隨著基因健康體檢的普及,獲取人的DNA從最常見的血液中DNA提取,逐步改為從口腔拭子中提取,最后變成了從唾液中提取DNA。相應的,獲取人的RNA也提出新的需求,希望從血液中提取改為從唾液中提取。
看似簡單的一個樣本變換需求,RNA的提取難度上卻大大地提高了。
首先,唾液是一個含大量細菌的混合液,1 ml唾液大約含1億個細菌,其次唾液中還含有大量的消化酶(最討厭的是含有RNA酶)、溶菌酶、免疫球蛋白、各種無機鹽離子以及白細胞、口腔脫落細胞、甚至包括病毒。在這一堆混合物中,真正我們所需要的是口腔脫落細胞及白細胞中的RNA,如何躲避RNA酶的攻擊,去除基因組DNA,提高RNA的回收效率,是提取唾液中RNA的三大難點。
針對上述難點,我們逐一采取了相應的應對措施:
1. 由于唾液中富含RNA酶,收集的唾液如果用于RNA提取必須立即滅活RNA酶,不能像血液一樣放置幾小時后再提取RNA。所以我們特別選擇了配套的唾液采集器,采集唾液后可立即混入裂解液,終止RNA酶的活性。
2. 由于基因組DNA比RNA更長,更粘稠,所以可以用特殊的過濾柱過濾唾液的裂解物,高效除去基因組DNA,卻不損失RNA的數量。
3. 如果從唾液中富集口腔脫落細胞或白細胞,必定會增加操作步驟,延長RNA酶攻擊RNA的時間,因此我們采取的方案是盡可能大體積地一次性提取RNA,但是由于RNA含量低,醇沉淀RNA根本不可行,所以采用核酸純化柱富集、純化RNA。
現將設計的唾液RNA提取方法公布如下:
我們用微量分光光度計來估計我們獲得的2個唾液中RNA的質量:
總體來說OD260/OD280接近2.0,純度很好,但是OD260/OD230比值很低,可能有鹽分殘留,但也不排除因為RNA濃度低,OD260 嚴重偏小所造成的假象。
用上述提取的唾液RNA擴增下β-actin,效果還是不錯的:
最后要補充的是,由于RNA的總量還不到1μg,在提取唾液RNA的過程中可以添加適量的Carrier RNA, 以提高最終RNA的回收效率。