最近有客戶反映在做熒光PCR時遇到了一個問題，就是以cDNA為模板做熒光PCR時，熒光曲線起線非常早（CT<10），但是擴(kuò)增結(jié)束后分析，熒光曲線卻呈陰性曲線或向下倒，而溶解曲線卻又有顯示，與目的基因的溶解曲線相同，都是單峰，且峰值相近。

根據(jù)客戶反饋的信息，我們對此現(xiàn)象進(jìn)行分析：因?yàn)槿芙馇€與目的基因的溶解曲線相同，表示擴(kuò)增體系是有擴(kuò)增的，且擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)該是所需目的基因。但是起線早，分析卻呈陰性狀態(tài)，這是為什么呢？我們對此現(xiàn)象進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)PCR預(yù)混液和引物沒有問題，問題應(yīng)該在模板上--我們猜測可能是在逆轉(zhuǎn)錄過程中在oligo -dT和隨機(jī)引物作用下形成了大量的cDNA-RNA雜交體，cDNA-RNA雜交體也是雙螺旋結(jié)構(gòu)，如下圖：

而SYBR Green PCR Mix中含有的SYBR Green I是一種結(jié)合于所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長的染料，它可能也會結(jié)合cDNA-RNA雜交體雙螺旋小溝區(qū)域從而產(chǎn)生熒光。

為了證明以上猜測，我設(shè)計(jì)了一個實(shí)驗(yàn)：

*注：RNA、cDNA及DNA必須是不參加PCR擴(kuò)增的，否則會影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

其他來源的RNA、cDNA或DNA代替水補(bǔ)足PCR體系，進(jìn)行PCR反應(yīng)，觀察其現(xiàn)象，結(jié)果如下圖：

從上圖可看出，以水或者以RNA代替水補(bǔ)足PCR體系進(jìn)行反應(yīng)時，PCR擴(kuò)增熒光曲線是正常的，但是以cDNA或DNA代替水補(bǔ)足PCR體系進(jìn)行反應(yīng)時，PCR擴(kuò)增熒光曲線就出現(xiàn)異常，但是溶解曲線卻都是在同一峰上，說明它們都在進(jìn)行正常擴(kuò)增，而以cDNA或DNA代替水補(bǔ)足PCR體系進(jìn)行反應(yīng)時會影響熒光的采集及結(jié)果的分析。這是因?yàn)樵?/span>PCR反應(yīng)時，SYBR Green I會結(jié)合于所有雙螺旋小溝區(qū)域而發(fā)出熒光，電腦系統(tǒng)也會將這些熒光采集并進(jìn)行分析，而且此時電腦是以3-15CT值間的平均熒光值作為熒光基線，如下圖：

這樣由于3號和4號在一開始就出現(xiàn)熒光值，這樣在3-15 CT值間的平均熒光值就變高了，以致后面的熒光值相對于基線熒光值就接近于0甚至更小，所以在電腦分析后就會出現(xiàn)類似陰性的曲線出現(xiàn)。但是如果此時將基線數(shù)據(jù)改變就會出現(xiàn)不同的情況，如下圖：

如果取1-2 CT值間的平均熒光值做基線，3號、4號就有起升曲線，這也說明前面的熒光平均值過高對結(jié)果分析會造成很大的影響。

所以如果出現(xiàn)這種情況，我建議使用特異性引物代替oligo -dT和隨機(jī)引物，或者適當(dāng)減少cDNA模板或者是RNA模板的用量。

新 景 生 物 實(shí) 驗(yàn) 室

 2016年4月29日