小新作為技術員，在進行SYBRGreen熒光PCR時也會經常碰到和顧客們一樣的問題，好好的實驗，結果熒光跑完了會出現一些奇怪的熒光曲線，那么面對這樣的結果，我們應該怎么來分析呢？接下來，小新帶大家看一些“不規矩”的熒光曲線，并一起來分析分析原因。

首先來看這種熒光曲線：

看到這一堆亂七八糟的線是不是就頭大？實際上這些樣本是存在一定的濃度梯度的【小新是按照10倍、100倍、1000倍這樣稀釋的】，然而這些樣本在實驗結果上看不出相應的差異，并且有些線在PCR后期會出現下降的趨勢。這樣的結果基本上顯示了樣本DNA濃度過高，因為熒光PCR儀檢測到熒光存在一個閾值【小新采用的這款儀器，它開始能夠接受的熒光起始值圍繞在15左右】，如果DNA濃度過高的話，在進行PCR擴增的前面幾個循環，儀器就已經開始能夠檢測到熒光，導致所有的曲線全都堆積在一起，無法分開。面對這種情況，小新建議大家多稀釋一些梯度【擴大稀釋倍數也可啊】，努力做到讓曲線分開。

第二種曲線乍看上去非常正常↓

有木有覺得很完美？？？！！！

但是如果小新告訴大家，這兩條線其實有一個是陰性對照，你們是不是就懵圈了呢？

實際上的樣本是這樣的！

肯定有小伙伴說你肯定在逗我吧！其實出現這種線的情況并不少見，多存在于熒光PCR的引物測試過程中。由于引物設計的不完美，導致PCR擴增過程中出現引物二聚體。當然除了看熒光曲線以外，還可以用融解曲線為佐證（不知道啥是融解曲線的小伙伴可以自行百度，度娘解釋的很清楚喲！）。

從圖上就可以明顯看出陰性對照與陽性對照的峰值并不在一起，也就是說陰性對照出現非特異性擴增，這個陰性的峰值就是引物二聚體的融解溫度。所以小伙伴們在做正式的熒光PCR實驗之前，一定要記得進行引物測試，以免遇到這種情況哦！

最后一種曲線就相對簡單的多了

接下來再看看它們的融解曲線（毫無章法的任性曲線)

大部分小伙伴看到這種曲線的第一反應就是：這明顯是陰性對照嘛！是的，圖上這三條曲線的樣本均為陰性測試但是這三條線在結尾還是出現了起線，我們在一般情況下也視為陰性，那么它出現起線的主要原因是什么呢？由于擴增體系中Mg離子濃度過高、退火溫度過低,及PCR循環次數等多重因素都會導致這種現象的發生。其次酶量過多有時也容易出現非特異性擴增。

好啦，今天的小新課堂講述了好多新的科普知識，希望小伙伴們在學習的過程中也能夠和小新多多交流，小新歡迎大家來信對小新課堂進行評價和指導！（畢竟小新也是個愛好學習的好孩紙！這是小新的郵箱：technical@simgen.cn 記得給我來信哦。么么噠！