“酶：大多是蛋白質，但少數具有生物催化功能的分子并非為蛋白質，有一些被稱為核酶的RNA分子也具有催化功能。此外，通過人工合成所謂人工酶也具有與酶類似的催化活性，包括人工合成的DNA。 有人認為酶應定義為具有催化功能的生物大分子，即生物催化劑……”邊看書邊打瞌睡的小新實在熬不住了，把書扔了，還是去實驗室點小實驗比較有意思。【千萬不要學小新不愛讀書，隔三差五要被領導教育QAQ】

實驗室里圍了一圈同事，原來是前幾天新訂的Taq酶到貨了，可是拿到東西的大師兄在做實驗的過程中犯了難。忍不住好奇的小新也把腦袋伸了過去。

原來是因為近期的技術服務需要做一個細菌16s的擴增，但是不同濃度的試驗樣本做出來的結果居然都是一樣的，小新死皮賴臉的把這份不正常的結果拿來了，情況確實很糟糕：大師兄的試驗采用梯度稀釋的樣本，分別由1稀釋到10^-6，但是從試驗結果來看，各個樣本的CT值均圍繞在15-17之間，也就是說，從熒光結果上完全看不出任何樣本差異啊！

引物序列：（F）TGTGTAGCGGTGAAATGCG

（R）TCGTTTACGGCGTGGAC        該段引物序列擴增產物片段長度為138bp

為了搞清楚為什么，小新開始重復大師兄的試驗，出來的結果依舊如此，排除實驗員操作的問題，那就是體系的原因了。正準備逐一排查到底是哪個實驗成分有問題時，小新發現了對照組陰性【就是沒有加入DNA模板的那組】居然和其他組的結果一樣，那就說明是體系里混進去了其他的DNA模板，并且是細菌的DNA模板。由于換了新的Taq酶才開始出現這種結果，那么頭號懷疑對象當然就是新的Taq酶咯。

問了一下師兄，現在的Taq酶是哪家公司的，師兄說是JL的，恰好小新手上還有一些其他公司的Taq酶，那就正好來個大檢查，看看到底是哪家公司的Taq酶混進去的DNA最多，還是大家生產的酶都混進去了很多DNA。

試驗過程倒是很簡單，通過簡單的陰性試驗就能出來結果。

小新選取了四種不同公司的酶：1、萊楓，2、JL，3、康為，4、TaKaRa，采用引物序列依舊是16s的通用引物。在此基礎上進行了全陰性試驗。一個多小時的等待，實驗結果終于出來了。

圖中的熒光線從前往后所用的酶依次是：JL、康為、TaKaRa、萊楓

觀察實驗結果，根據CT值的分析，JL的CT值最為靠前，也就是說其含細菌DNA濃度最高，其余三家公司的Taq酶也都存在DNA殘留。也就是說無論是哪家公司的Taq酶都無法做出真正意義上的陰性結果。那么這樣的Taq酶對普通的16sPCR擴增是否也存在影響呢？好奇的小新進行了16s普通 PCR全陰性擴增，再對擴增產物進行電泳，出來的結果如圖：

注：普通的16s 采用的引物序列為： F  AGAGTTTGATCCTGGCTCAG

R  GGCTACCTTGTTACGACTT

該段引物序列擴增產物片段長度為1497bp

從電泳圖可以清晰的看出，JL、康為和TaKaRa公司產出Taq酶在進行陰性16s擴增時，也會出現隱約的條帶當然，這并不排除環境中細菌DNA的污染。

結論：作為Taq酶生產廠家都會盡力設法去除殘留的大腸桿菌基因組DNA。但是有Taq酶生產廠家曾表示，Taq酶由于本身就會結合一部分DNA，因此Taq酶殘留的幾百bp細菌DNA是無法徹底去的除，本次實驗驗證了該廠家的論述，同時也說明用擴增短片段的通用性16s細菌引物檢測細菌數量是不可靠的，應當設計特異性的細菌引物檢測細菌，才能使試驗結果更具有說服性。好啦，這期的小新課堂結束了，我們下期再會！