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如果大家拿到一株未知真菌，想檢測(cè)真菌種屬，該怎么做呢？今天小編就在這里為大家講一下未知真菌的DNA提取、凝膠回收、測(cè)序分析及進(jìn)化樹的繪制。
一、準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)試劑及儀器：
1．DNA提取：植物DNA試劑盒（simgen，Cat.No.3201-050），液氮；
2．PCR 試劑：2 × Taq PlusPCR Master Mix（Simgen，Cat.No.7005100），
引物（ITS 1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG
ITS 4：TCCTCCGCTTATTGATATGC）；
3．DNA Marker：DL2000 Ladder（simgen，Cat.No.MD1006）；
4．PCR產(chǎn)物純化：凝膠DNA回收試劑盒（simgen，Cat.No.2001-050）；
5．實(shí)驗(yàn)儀器：水浴鍋，離心機(jī)，研缽，電泳儀，PCR儀，移液器，Sim-100超微量紫外分光光度計(jì)（simgen，Sim-100）。
注：1. 植物DNA試劑盒（simgen，Cat.No.3201-050）可用于真菌DNA提取；
2. 引物由Invitrogen公司合成。
二、DNA的提取及濃度測(cè)定：
1． 將真菌從培養(yǎng)基上刮下或從菌液中收集，轉(zhuǎn)至研缽中，加入液氮研磨至面粉狀；
2． 研磨充分后加入500μl 65℃預(yù)熱的Buffer PL，繼續(xù)研磨一段時(shí)間，取500μl混合液至潔凈的1.5ml離心管中（若不足500μl 混合液，加Buffer PL補(bǔ)至500μl ）；
3． 接下的步驟按照植物DNA試劑盒（simgen，Cat.No.3201-050）說明書操作，100μl Buffer TE洗脫DNA；
4． 測(cè)OD。
真菌DNA提取結(jié)果：
編號(hào) | OD260 | OD280 | OD230 | 260/230 | 260/280 | 濃度(ng/μl) |
1 | 2.82 | 1.49 | 1.32 | 2.14 | 1.90 | 140.92 |
2 | 2.21 | 1.19 | 1.07 | 2.07 | 1.86 | 110.54 |
三、PCR擴(kuò)增及回收純化：
1． 按下表配置PCR體系
試劑 | 用量 |
2× Taq PCR MASTER Mix（Simgen） | 20μl |
Primer 1（10mM） | 1μl |
Primer 2（10mM） | 1μl |
ddH2O | 13μl |
Template | 5μl |
2. PCR反應(yīng)程序：
PCR 反應(yīng)條件
3. 電泳檢測(cè)及凝膠回收：
PCR產(chǎn)物電泳圖：
凝膠回收：
A. PCR產(chǎn)物電泳，并切膠（注：膠最好切得薄一點(diǎn)）；
B. 按照凝膠DNA回收試劑盒（simgen）說明書操作，30μl Buffer TE洗脫DNA,并測(cè)OD值。
凝膠回收DNA結(jié)果：
編號(hào) | OD260 | OD280 | OD230 | 260/230 | 260/280 | 濃度(ng/μl) |
1 | 2.331 | 1.262 | 1.839 | 1.27 | 1.85 | 116.53 |
2 | 2.265 | 1.231 | 2.063 | 1.10 | 1.84 | 113.24 |
四、將凝膠回收產(chǎn)物送測(cè)序公司測(cè)序
測(cè)序結(jié)果繪制進(jìn)化樹：
從以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以分析得到此真菌與比對(duì)到的真菌有非常近的親緣關(guān)系，應(yīng)該也是屬于Paecilomyces。
如有不理解的，可以聯(lián)系杭州新景生物試劑開發(fā)有限公司技術(shù)部：892873021@qq.com。
新景生物實(shí)驗(yàn)室
2016年04月20日
·樣本通用性強(qiáng)：植物、真菌、糞便、細(xì)菌、動(dòng)物組織、血液均可適用·樣本取樣范圍大：50~200 mg均可適用，特別適合從無法徹底溶解的生物樣本中提取總DNA·操作步驟簡(jiǎn)潔、快速，無需蛋白酶K消化及添加乙醇步驟，30-40分鐘內(nèi)即可完成植物總DNA的制備·特殊設(shè)計(jì)的溶解液有效應(yīng)對(duì)植物中的多糖衍生物的干擾·特別優(yōu)化配置的核酸純化柱僅高效吸附大片 查看產(chǎn)品
·20-30分鐘內(nèi)即可完成凝膠中DNA的回收·最高可以達(dá)到85%的回收效率·核酸純化柱無須平衡液處理，最大吸附30 μg DNA·溶液中所含的pH指示劑可直觀地判斷溶液中DNA與硅膠膜的最適宜結(jié)合條件·特別設(shè)計(jì)的純化柱，可用25 μl微量洗脫體積洗脫DNA·應(yīng)用：DNA測(cè)序、基因芯片分析、DNA連接與轉(zhuǎn)化、限制性酶切、標(biāo)記微注射、PCR、體外轉(zhuǎn)錄 查看產(chǎn)品
添加兩種優(yōu)化的Loading Buffer染料，不遮擋DNA條帶熒光亮度條帶細(xì)致調(diào)整，每一個(gè)片段都足夠清晰 查看產(chǎn)品