質粒DNA的提取是分子生物實驗技術中的必備實驗技能，市場中有許多質粒DNA提取的試劑盒，但是你是否想過自己動手制作一個質粒DNA試劑盒呢？這次就由小編來教大家怎樣利用實驗室常用資源來制作一個高純高效的柱純化質粒DNA試劑盒。

第一，所在實驗室必須擁有這些常用試劑：葡萄糖、Tris、HCl、EDTA、NaOH、SDS、乙酸鉀、冰乙酸、無水乙醇、異丙醇和超純水；

第二，利用這些試劑配制質粒DNA提取所需的溶液：

堿裂解溶液Ⅰ：50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl（pH8.0），10mM EDTA（pH8.0）;

堿裂解溶液Ⅱ：0.2M NaOH，1%（m/v） SDS;

堿裂解溶液Ⅲ（100ml）：5M 乙酸鉀 60ml，冰乙酸  11.5ml，純水28.5ml;

70%乙醇（50ml）：35ml無水乙醇加15ml超純水

    第三，我們可以去淘寶上購買質粒DNA純化柱（simgen，7002050）、RNase A（simgen，8001-001）。

所需的試劑都準備齊了，接下來，小編教大家怎樣利用這些資源來提取質粒DNA：

1. 收集細菌，用1.5ml離心管收集1-5ml過夜培養的細菌；

2. 向離心管中加入250μl堿裂解溶液Ⅰ懸浮細菌（漩渦振蕩或移液器吹打）；

3. 接著向溶液中加入250μl堿裂解溶液Ⅱ裂解細菌（溫和上下顛倒離心管數次）；

4. 接著再向溶液中加入250μl堿裂解溶液Ⅲ中和溶液（溫和上下翻轉離心管數次）；

5. 13000rpm高速離心10min，取上清至另一潔凈的離心管中；

6. 向溶液中加入275μl的異丙醇，混勻（溫和上下顛倒離心管數次或移液器吹打數次）；

7. 將溶液全部轉至純化柱中（由于體積過大，溶液分兩次過柱）；

8. 12000rpm高速離心30s，棄濾液；

9. 向純化柱中加入70%的乙醇；

10. 12000rpm高速離心30s，棄濾液；

11. 13000rpm高速離心2min，將純化柱置于潔凈的離心管；

12. 向純化柱中加入60μl超純水（雙蒸水），靜止2min;

13. 12000rpm高速離心30s，洗脫即可得到高純質粒DNA。

注意事項：

1. 此實驗自制質粒DNA試劑盒所用的純化柱和RNase A均是使用simgen的產品，倘若使用其他公司或其他序號的產品，可能會導致實驗數據變化；

2. 在實驗前將RNase A加到堿裂解溶液Ⅰ中，濃度是100μg/ml;

3. 加入堿裂解溶液Ⅱ后應馬上翻轉且這步不能超過5min;

4. 異丙醇的體積不要太大，否則會有大量RNA殘留。

    為了檢測自制的質粒DNA試劑盒的性能，小編用1個快速質粒DNA試劑盒產品（simgen）來做對照，所得的質粒DNA的詳細OD值見下表：

1、2為對照試劑盒提取得到的質粒DNA，3、4為自制試劑盒提取得到的質粒DNA。

電泳結果圖：

從OD值和電泳圖可以看出，自制的質粒DNA試劑盒所提取的DNA在濃度上和RNA殘留量都和對照的質粒DNA試劑盒相似，并無明顯的差異，而且自制的試劑盒所提取的DNA的鹽分殘留更少。

好了，今天的新景生物實驗室：分子生物百科就到這里了。大家覺得感興趣的話，可以自己動手試試哦，我們下期再見！！

                                                2016年3月23日

                                                新景生物實驗室