新景實驗室在去年時接到一些質粒提取的技術服務，其中有相當一部分是低拷貝質粒的細菌，這些細菌過夜培養后（OD600=3.2）的每毫升菌液一般只能提到2微克左右的質粒。就是說如果我們需要提取2mg的質粒，我們就需要培養1L以上的菌液來提取，但這只是在100%提取效率的理論狀態下所需的量，而實際操作中是不可能達到100%地提取到所有的質粒，一般最多能得到80%-90%的提取率，我們先看一下下表數據：

1、2為3ml細菌進行質粒小提，60μl洗脫得到的質粒DNA；3、4為100ml細菌進行質粒中抽，2ml洗脫得到的質粒DNA；5、6是2ml質粒中抽的DNA溶液進行DNA濃縮，100μl洗脫得到的質粒DNA。

從上表可以看到我們用100ml菌液進行一次質粒中抽，只能得到115μg左右的高濃度質粒DNA，就是說我們要提2mg的質粒就需要培養2L左右的菌液，要進行20次左右的質粒中抽。這樣不僅耗時長，而且成本高，效率低，那么怎樣才能提高低拷貝質粒的提取效率呢？

小編通過查找文獻發現一種可以提高低拷貝質?？截悢档姆椒ǎ褪窃诩毦幱趯瞪L中期的時候加入氯霉素，因為氯霉素會抑制蛋白質合成，從而抑制細菌的繁殖，但是卻不會抑制細菌的質粒合成，故此時細菌中的質粒仍可以復制合成。

為了驗證，小編做了一些實驗，首先挑取單菌落至5ml菌液中（2支），加入對應抗生素，37℃220rpm 培養2-3h，將兩支菌液各全部轉入300ml含相應抗生素的菌液中37℃220rpm 培養6-8h，此時細菌進入對數生長中期，然后向其中一瓶加入氯霉素至終濃度為170μg/ml，兩瓶菌液37℃220rpm 繼續培養12-16h左右。

然后取3ml菌液各兩支以及相同干重量細菌各兩支，編上編號，進行質粒DNA小提，60μl洗脫得到的質粒DNA并測OD，結果如下表：

1、2為3ml正常培養的菌液，3、4為3ml含氯霉素的菌液，5、6為5mg干重正常培養的菌體，7、8為5mg干重含氯霉素的菌體。

從上表中我們可以看出，在相同菌液量的時候，質粒DNA總量并無多大提高，而在相同菌體干重下卻有很大的提高，這是因為氯霉素抑制細菌生長繁殖導致每毫升菌液中細菌少，又因為氯霉素不會抑制質粒DNA的復制合成，所以相同細菌個數下質粒DNA量提高了。

在這個實驗中我們必須注意幾點：

1. 細菌必須是含松弛型低拷貝質粒DNA，如果是嚴緊型細菌，就不能用這種方法，因為這種質粒DNA的復制是隨著細菌染色體復制而復制合成的；

2. 細菌必須在細菌的對數生長中期加入氯霉素，因為過早加入時，細菌量太少，無法太多的細菌用以提取質粒DNA，而超過這個時期，細菌量過多，菌量達到飽和，部分菌體停止復制合成質粒DNA，此時加入氯霉素，效果已經不明顯了；

3. 在細菌培養的操作過程中要保證無菌操作，避免雜菌污染；

好了，今天的新景實驗室：分子生物百科就到這里了，希望今天的內容能對大家今后提取低拷貝質粒有所幫助，我們下期再見??！

                                               2016年3月11日

                                                 新景生物實驗室