之前收到客戶反饋說我們的DL2000 Ladder凝膠電泳條帶分不開，小新第一時間聯想到曾經也收到過類似的反饋，當時研究后發現是由于使用的核酸染料濃度過高導致了條帶拖尾、分不開，還寫了一篇文章——《怎樣做一張漂亮的瓊脂糖凝膠電泳圖（續）》。于是小新就讓客戶減少核酸染料的用量，但結果仍是不理想。經過和客戶的仔細溝通后了解到，客戶使用的核酸染料是Gelred，而Simgen實驗室用的核酸染料是EB（溴化乙錠）。那是不是因為Gelred和EB在使用效果上的不同所導致的差異呢？于是小新進行了以下實驗測試。

一、實驗目的

通過凝膠電泳，探究Gelred核酸染料對電泳結果的影響。

二、實驗材料

Gelred（Biotium）

EB（溴化乙錠）（Simgen Cat.No.9026001）

DL2000 Ladder（Simgen Cat.No.MD1006）

50×TAE（Simgen Cat.No.9001500）

瓊脂糖（BIOWEST REGULAR AGAROSE G-10）

電泳儀（北京六一儀器廠，DYY-6C型 ）

三、實驗方法及結果

1. 按照客戶的實驗條件：每100 ml的瓊脂糖凝膠加10 μl的Gelred制作1%凝膠進行電泳測試，結果如圖一。圖二為對照的EB染料的凝膠電泳（每100 ml的瓊脂糖凝膠加10 μl的EB染料）。DL2000 Ladder的用量均為5 μl。

2. 將Gelred的濃度稀釋10倍（圖三）和100倍（圖四）后，按每100 ml的瓊脂糖凝膠加10 μl稀釋后的Gelred制作1%的凝膠，取5 μl DL2000 Ladder進行電泳，結果如下。

3. 用泡染法進行Gelred染色，方法如下：

①　制作一塊不含Gelred的1%凝膠，進行電泳。

②　將GelRed（10000×）稀釋約3300倍到0.1 M NaCl溶液中，制成3×染色液。（例如將15 μl GelRed（10,000×）和5 ml 1 M NaCl加到45 ml純水中）。

③　將凝膠小心地放入合適的容器中。緩慢加入足量的3×染色液浸沒凝膠，室溫浸泡30分鐘進行染色，結果如圖五。

四、分析與討論

1. 由圖一和圖二可知，核酸染料用量為10 μl/100 ml凝膠時，DL2000 Ladder在Gelred作為核酸染料的凝膠上確實跑不開，但在EB作為染料的凝膠上帶型正常。

2. 由圖三和圖四可知，隨著Gelred的用量減少，DL2000 Ladder的條帶逐漸清晰分開。

3. 由圖五可知，Gelred泡染法對DL2000 Ladder條帶分離沒有影響。Gelred的說明書上也有說明：因為Gelred的分子量比較大，可能會影響DNA的遷移效果，如果預制膠（將Gelred加入凝膠中進行電泳的膠）的條帶彌散或分離不理想，建議減少DNA用量、減少Gelred用量或者使用泡染法染色。原文如下：

4. 經過進一步的測試對比，我們還發現：用酶切產物制作的DNA Marker在含Gelred的瓊脂糖凝膠上電泳更容易產生條帶分不開的現象，但是用PCR擴增產物制作的同一種DNA marker在含Gelred的瓊脂糖凝膠上電泳卻不受影響。

最后我們理一下思路，大致可以推斷出Gelred給我們電泳帶來困擾的原因了：據說Gelred是用多碳鏈烴鏈接兩個乙錠基團形成的大分子（合成大分子的目的是為了使乙錠基團不能進入細胞），既然一個Gelred分子中含有兩個乙錠基團，那么這個Gelred分子中的兩個乙錠基團分別嵌入到不同DNA分子中的概率就大大地提高了。這時候Gelred就像一個扣子，在電泳的過程中把兩條DNA分子硬生生粘連成了一條DNA分子，這就是電泳模糊不清的主要原因！而一個EB分子是不可能同時嵌入到兩個DNA分子中的，所以最多只能影響DNA的遷移速度（表現為DNA條帶變寬，而不是變模糊）。當我們用泡染法進行Gelred染色的時候，DNA已經完成不同長度片段的分離了，這時候染料再嵌入，電泳條帶自然就不會受影響了。同時，這也解釋了為什么酶切產物制作的DNA Marker受Gelred影響最嚴重，因為酶切產物的粘性末端容易配對，一旦配對，兩個乙錠基團分別嵌入到不同DNA分子中的概率又再次大大地提高了。

說了這么多，怎么感覺Gelred帶來的麻煩這么多，用Gelred跑電泳不就是讓我們聰明的科研腦袋交智商稅么？要知道，EB到現在還只是可疑的致癌物質，畢竟到目前為止還沒有任何證據證明直接接觸EB能對任何動物有毒害性，因為溴化乙錠的分子量也不小，并不能通過皮膚進入細胞內。不過既然目前Gelred作為公認無毒的核酸染料已經被各個實驗室所接受，那我們還是給正在使用Gelred的同學提一些建議：

1. 如果電泳條帶（特別是有多種核酸條帶混在一起的，比如DNA Marker、酶切產物、總RNA之類）模糊不清的，請嘗試減少Gelred的用量，觀察問題是否能夠解決。

2. 如果還不能解決，嘗試減少核酸的用量。因為核酸用量減少也能降低Gelred搭上兩條核酸分子的概率。

3. 1、2方案都解決不了，嘗試泡染法。

4. 干脆直接用EB制膠電泳。附帶說一句，Gelred既然是用多碳鏈烴鏈接兩個乙錠基團形成的，那兩個乙錠基團也是有脫落風險的，所以使用Gelred時請和使用EB一樣做好防護措施。

最后告訴大家一個好消息：經過Simgen技術人員耗時一個多月的研究和改進后，新版的DL2000 Ladder（PCR擴增產物制作）從去年1月份（批次20220129以后）開始升級上線了，新版DL2000 Ladder在Gelred（10 μl/100 ml凝膠）凝膠電泳中完全沒有影響（圖六），歡迎大家放心購買。