長片段PCR技術心得分享

PCR技術自1983Mullis發明以來，給生命科學帶來了歷史性的變化，現已成為分子遺傳學、基因組測序和作圖、法醫學、系統動物學等各領域內不可缺少的工具。但是，普通的PCR最長只能擴展2-3kb左右的短片段基因，對于5kb以上的長片段基因很難有效的擴增，這使PCR受到了很大限制。故人們一直以來都在嘗試利用PCR擴展出更長片段的PCR。

“LongPCR”這個名詞和技術最早由美國華盛頓大學醫學院的Barnes WM提出。其設想來自于他1992年一次實驗錯誤。最初他想用常規PCR方法擴增來自Bacillus thuringiensis(Bt，蘇云金桿菌)的一種2kb的蛋白質基因。在實驗過程中使用的引物末端出現了差錯,模板鏈上是A的位點，其對應的引物位點也是A，這一位點不匹配導致了PCR擴增反應終止,未得到預期產物。Barnes用的聚合酶是Klentaq1，是TaqDNA聚合酶N端缺失突變體，無外切酶和內切酶活性。為解決模板--引物不匹配問題,他試著用另一種聚合酶Pfu來代替Klentaq1，此酶具3→5外切酶功能，但結果還是沒有得到預期產物。Barnes設想Pfu可能過多地切掉了引物末端的核苷酸，就將Klentaq1和少量的Pfu結合使用,竟然成功了。Barnes解釋其原因是“Pfu需要切除不匹配的核苷酸，使Klentaq 1繼續擴增”。Barnes進一步設想，如果引物與模板不匹配能導致PCR終止，那么聚合酶延伸過程中產生的不匹配是否也會對擴增反應產生同樣的終止作用呢？如果是的話，那么這就是限制PCR產物長度的主要因素。正是基于這種思路，Barnes確立了用雙聚合酶系統來擴增長目標序列,即無外切酶功能的DNA聚合酶(主導酶，majorpolymerase)和具 3→5校對功能的DNA聚合酶(校對酶，minorpolymerase) 的組合，最后得到了長達28kb的產物。由此人們開始打開長片段PCR的大門，最終科學家發展出了一種新PCR技術———長PCR(longPCR)，用于擴增大于5kb的DNA片段。至今為止，長PCR技術已成功地用于擴增人類β球蛋白基因簇22kb的DNA片段、噬菌體基因組42kb的片段和人類線粒體基因組16.3kb的片段。

我是從13年開始嘗試擴增長片段的，在經過一些摸索，并不斷的改變PCR條件，終于擴增出8.5kb長的人類基因組DNA。經過這兩年的時間，我整理了一些限制長片段PCR的因素及一些解決方法：

1.DNA模板的質量問題

a. 模板提取不完整，其中不含你的目的基因，或目的基因含量太低。這個情況下應該使用較為新鮮的樣本以及較為溫和的提取方法來降低DNA模板因在提取過程中損傷情況。

b. 模板里面殘留某種試劑成份，可能抑制Taq聚合酶的活性，如果是這種情況，可以用試劑盒把模板再純化一下，或將模板做個梯度稀釋以確定最佳的模板量。

2. DNA聚合酶的影響

a. Taq酶具有較高的錯誤率，導致產物3’端出現錯配堿基，DNA合成提前結束。這時應該使用一些錯配率更低的耐熱聚合酶，如klentaq、pfu、rTth、Vent等。從不同文獻中可以得到使用雙酶系統更有利于長片段DNA的合成。

b. Taq酶在PCR的過程中活力下降，會增加非特異擴增以及二聚體的出現。這時應該使用緩沖能力較強的緩沖液，使緩沖液的pH值不會降得過低而影響酶活性；也可在PCR體系中添加一些促進劑，以降低退火溫度或/和提高聚合酶的穩定性，從而促進長片段擴增的進行；也可稍微降低變性溫度，以保證聚合酶的活性。

3. 在PCR過程中損傷了DNA模板，使其斷裂或脫嘌呤，導致長片段PCR無法進行。這時我們可稍微降低變性溫度或/和在PCR體系中添加一些促進劑，以降低退火溫度，從而減少DNA模板的損傷。

   4. 引物問題

 a. 樣品自身的基因型差異導致擴增失敗。也就是說你的引物與某些基因型的樣品結合的好，而和另一些基因型結合不好。可以設計一對更保守的引物試試。

 b. 引物設計的不好，會導致二聚體出現、非特異性擴增或無法擴增。長片段PCR的引物設計原則和普通PCR一樣，只是較長一些（21-34個核苷酸），以便提高退火溫度，從而提高反應的特異性。但也不要太長，以免引物間互補形成二聚體。

5. 模板的結構復雜度

    對于模板結構復雜，如GC含量高（>60%），有二級結構等，普通的長片段PCR可能難以延伸下去，加入DMSO等助熔劑可幫助擴增順利進行，但DMSO有毒，而且用量需要優化。

   6. 非特異性擴增或擴不出條帶，這時可以通過調整PCR體系或調整PCR程序來減少非特異性。

    根據這些經驗和資料，我首先對雙酶系統進行確定，我先后用過許多公司不同的酶組合，最后我選擇了北京佳蘭生物的klentaq酶和pfu酶進行組合，klentaq與pfu酶的比例是20:1。

接著，我先挑出一個能擴增3.6kb的10×buffer（參考分子克隆實驗指南（第三版）中長片段PCR，上冊 668頁），然后再用這10×buffer來擴增8.5kb。當然，8.5kb不是那么好擴的，一開始并未擴出目的基因，在經過調整一些組分后，主要是增加了鎂離子和dNTPS的濃度，我將鎂離子濃度增加到4.5mM，dNTPS增加到750μM each。終于擴出了8.5kb長片段基因，雖然還有很多非特異性擴增。下面來看看我的實驗實例：

首先是模板，我要確保DNA模板的完整以及純度，我用的是全血DNA試劑盒（simgen）來提取人類基因組DNA，并將DNA測OD及跑電泳。其次是引物，我用的是資料中常用的Human β-globin gene8.5kb引物，由英濰捷基合成。

引物：Forward  TGATAGGCACTGACTCTCTGTCCCTTGGGCTGTTT

      Reverse  ACATGATTAGCAAAAGGGCCTAGCTTGGACTCAGA

電泳圖：

從上圖可以看出，甜菜堿在此時對長片段PCR反應沒有促進作用，反而有抑制作用，也許是甜菜堿將熔點降低以致退火溫度下降而阻礙了長片段PCR反應的進行。