前段時間為了擴展物種源性鑒定試劑盒的種類，決定增加馬源和驢源的鑒定試劑盒。在研發(fā)階段遇到了一些意想不到的事情，今天小新來和大家分享一下。

物種源性鑒定試劑盒采用TaqMan實時熒光PCR技術，根據各物種間基因序列差異而進行動物源性成分鑒定。本次馬和驢的特異性引物及探針是采用了《SB/T 10923-2012 肉及肉制品中豬、牛、羊、馬、驢、雞、鴨、鵝、兔源性成分的快速鑒定 實時PCR法》，具體序列如下：

馬源性成分檢測用引物（對）序列為：

FP：5′- CCAATGCGTATTCTGACTCTTAGTG -3′

RP：5′- CGATAATTACGTATGGGTGTTCC -3′

Pro：5′ FAM- CTGACACTAACATGAATCGGCGGACAGC-TAMRA 3′

驢源性成分檢測用引物（對）序列為：

FP：5′- CCTCAGCACTCCCCCTCAT -3′

RP：5′- AAGGATAAGGGCTAATACACCA -3′

Pro：5′ FAM- CCAGAATGGTATTTCCTATTTGCTTACGCC-TAMRA3

引物和探針搞定后，接下來就是DNA了，為此小新專門在淘寶上購買了一份馬肉和一份驢肉，然后用Simgen動物組織DNA試劑盒（Cat.No.3101050）分別提取馬肉和驢肉的DNA。

最后就是PCR擴增測試了，在配置擴增試劑的時候，小新突然想到網上說的驢肉頻繁造假事情，再加上買的驢肉居然比馬肉還便宜，心里有些不踏實，于是決定驗證一番。擴增曲線如下：

5-8是用的驢特異性引物探針，5是陰性對照，6、7是提取的驢肉DNA，8是提取的馬肉DNA1-4是用的馬特異性引物探針，1是陰性對照，2、3是提取的馬肉DNA，4是提取的驢肉DNA

購買的馬肉看來是真的，擴增結果無異常。但是驢肉確實是假的，這個所謂的驢肉不能用驢的特異性引物探針擴增出來，但可以用馬的特異性引物探針擴增出來，只能說明這是馬肉造假的驢肉。

于是小新又換了一家淘寶店購買驢肉，并和店家溝通了一番。在了解到小新是為了做物種檢測后，商家大方的送了一根帶點肉的驢骨做檢測用。用骨頭上帶著的驢肉提取了DNA并進行了PCR擴增，結果如下：

5-7是用的驢特異性引物探針，5是陰性對照，6、7是新提取的驢肉DNA1-4是用的馬特異性引物探針，1是陰性對照，2、3是提取的馬肉DNA，4是新提取的驢肉DNA

結果顯示新提取的驢肉DNA不僅能用驢的特異性引物探針擴增出來，同時也可以用馬的特異性引物探針擴增出來，不過擴增效率要差一些。

小新與小伙伴們對于這一結果經過多番探討，覺得有兩種可能：

1．懷疑驢肉上沾染到了馬的DNA。于是敲開驢骨，提取了3管骨髓的DNA進行PCR。擴增結果如下：

5-8是用的驢特異性引物探針，5是陰性對照，6、7、8是提取的驢骨髓DNA1-4是用的馬特異性引物探針，1是陰性對照，2是提取的馬肉DNA，3、4是提取的驢骨髓DNA

結果顯示驢骨髓DNA仍舊能用馬的引物探針擴增出來，這說明不是樣本的問題。

2．懷疑馬的引物有問題。于是專門去NCBI上Blast，發(fā)現(xiàn)確實有點問題，用馬的引物進行Primer-BLAST時，查找生物選擇驢（Equus asinus），最后居然也找到了對應的序列，當然其中有個別堿基不同，這應該就是為什么擴增效率低的原因吧。之后小新又重新合成了一組新的引物探針，這次采用的是《SNT 3730.5-2013 食品及飼料中常見畜類品種的鑒定方法 第5部分：馬成分檢測 實時熒光PCR法》中的引物探針序列，并且上NCBI又核對了一遍，確認沒有問題。最后擴增結果如下：

 結果證實確實是引物探針存在問題。

總結

1. 馬和驢都是屬于脊索動物門、脊椎動物亞門、哺乳綱、奇蹄目、馬科、馬屬，只有種不一樣，親緣關系比較近，導致兩者間的基因有很多相同或者類似的，因此設計引物時需要多加注意。我們的實驗證明了《SNT 3730.5-2013 食品及飼料中常見畜類品種的鑒定方法 第5部分：馬成分檢測 實時熒光PCR法》中設計的馬引物探針序列比較靠譜，《SB/T 10923-2012 肉及肉制品中豬、牛、羊、馬、驢、雞、鴨、鵝、兔源性成分的快速鑒定 實時PCR法》中的馬引物探針設計有缺陷，建議不要采用。

2. 造假情況比我們想象的還要接近我們的生活，就像這次買的“驢肉”，當時還是挑選的一家銷量不錯的店，沒想到還是被騙了。由于賣家對我們這種專業(yè)做物種源性檢測的用戶還拒不認錯，我們決定曝光一下這家淘寶天貓店——味健旺旗艦店，提醒大家不要上當受騙。

3. 這次實驗可謂是一波三折，不僅買的樣品出現(xiàn)造假情況，就連非常嚴肅的參考資料都可能有漏洞。這就提醒我們不能盲目相信網上的各種信息，科學地設計實驗，細心地驗證，才是最有保障的獲取知識的方法。

備注：實驗所采用的一些儀器、設備、試劑如下

試劑：

動物組織DNA試劑盒（Simgen，Cat.No.3101050）

2×Probe qPCR Mix（Simgen，Cat.No.7206100）

儀器：

超微量電子天平（DENVER INSTRUMENT，TP-213）

旋渦震蕩器（越新儀器，XH-C）

臺式離心機（eppendorf Centrifuge 5415 D）

超微量分光光度計（Simgen Cat.No.sim100）

熒光定量PCR儀（ABI7500）