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上次用Simgen細(xì)菌DNA試劑盒提取細(xì)菌DNA的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了劇烈操作提取的DNA濃度確實(shí)比溫和操作提取的要高。但是一位較真的同學(xué)就提問(wèn)了，細(xì)菌樣本和血液樣本畢竟是完全不同的樣本，細(xì)菌DNA提取的效果一定代表血液DNA提取的效果嗎？實(shí)踐是檢驗(yàn)真理的唯一標(biāo)準(zhǔn)，為了精確回答用戶的疑惑，這次小新就用血液再來(lái)實(shí)際測(cè)試一下。
實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/strong>
測(cè)試全血DNA小量試劑盒提取過(guò)程中劇烈操作與溫和操作對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。
實(shí)驗(yàn)材料：
EDTA抗凝全血、全血DNA小量試劑盒（Simgen Cat. No.3001050）
DNA Maker: Simgen 1 kb Marker（Simgen Cat. No.MD1004）
2×PCR Mix（Simgen Cat. No.7003100），Human β-globin gene引物（Forward：TTAGGCCTTAGCGGGCTTAGAC；Reverse：CCAGGATTTTTGATGGGACACG）。
旋渦震蕩器（越新儀器，XH-C）
臺(tái)式離心機(jī)（eppendorf Centrifuge 5415 D）
超微量分光光度計(jì)（Simgen Cat.No.sim100）
電泳儀（北京六一儀器廠，DYY-6C型 ）
實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：
劇烈操作 | 溫和操作 |
1. 加300 μl Buffer L1到1.5 ml離心管中。 2. 加入400 μl抗凝全血，蓋上管蓋，旋渦振蕩30秒。 | |
3. 加入300 μl Buffer L2，劇烈搖晃離心管3~5次，再旋渦震蕩30秒混勻。 | 3. 加入300 μl Buffer L2，溫和的上下顛倒混勻30秒。 |
4. 13000 rpm離心2分鐘。 5. 將步驟4中的上清液倒入到核酸純化柱中（核酸純化柱置于2 ml離心管中），蓋上管蓋，12000 rpm離心30秒。 6. 棄2 ml離心管中的濾液，將核酸純化柱置回到2 ml離心管中，在核酸純化柱中加入500 μl Buffer WA，蓋上管蓋，12000 rpm離心30秒。 7. 棄2 ml離心管中的濾液，將核酸純化柱置回到2 ml離心管中，在核酸純化柱中加入600 μl Buffer WB，蓋上管蓋，12000 rpm離心30秒。 8. 棄2 ml離心管中的濾液，將核酸純化柱置回到2 ml離心管中，14000 rpm離心1分鐘。 9. 棄2 ml離心管，將核酸純化柱置于一個(gè)潔凈的1.5 ml離心管中，在純化柱中央加100 μl Buffer TE，蓋上管蓋，室溫靜置1分鐘，12000 rpm離心30秒。 10. 在超微量分光光度計(jì)上測(cè)量提取到的DNA的濃度。 11. 以18 μl提取的DNA作為模板，用2×PCR Mix擴(kuò)增Human β-globin gene，目的基因長(zhǎng)約1.3 kb。 12. 對(duì)提取到的DNA和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。 | |
實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
1. 在超微量分光光度計(jì)上用Buffer TE調(diào)零，測(cè)量提取的DNA，結(jié)果如下：
2. 在1%的瓊脂糖凝膠上，加入5 μl提取到的DNA，電泳30 min，結(jié)果如下：
3. 在1%的瓊脂糖凝膠上，加入5 μl擴(kuò)增產(chǎn)物，電泳20 min，結(jié)果如下：
實(shí)驗(yàn)討論與分析：
1. 從超微量分光光度計(jì)測(cè)量的結(jié)果上可以看出，劇烈操作提取的DNA濃度是溫和操作提取的2倍左右，沒(méi)有之前細(xì)菌實(shí)驗(yàn)時(shí)那么大的差異。Abs260/280和Abs260/230差別不大，數(shù)值都比較不錯(cuò)。
2. 從圖一可以看到，兩種操作方法提取的DNA電泳的位置差不多，劇烈操作提取的DNA的亮度明顯亮于溫和操作提取的DNA，與分光光度計(jì)測(cè)得的數(shù)據(jù)有較好的對(duì)應(yīng)關(guān)系。
3. 從圖二可以看到，兩種操作方法提取的DNA均對(duì)PCR擴(kuò)增沒(méi)有影響，即使模板用量為18 μl（總體系為40 μl）也能成功擴(kuò)增出目的片段。
本次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果倒是有點(diǎn)出乎意料，原本按照細(xì)菌提取的結(jié)果推測(cè)，差異應(yīng)該會(huì)比較明顯，但是實(shí)際血液提取的結(jié)果卻沒(méi)有那么明顯的差異（上次細(xì)菌樣本提取DNA的結(jié)果相差了4倍，這次血液樣本提取DNA的結(jié)果只相差了2倍）。之所以會(huì)有以上差異，我們推測(cè)可能的原因如下：第一種可能，血細(xì)胞比細(xì)菌細(xì)胞更容易溶解，溫和操作條件下釋放DNA效率更高；第二種可能，是因?yàn)槲覀儽敬问褂玫难獦?/span>是凍存在﹣80℃冰箱中的，解凍的過(guò)程相當(dāng)于給血液細(xì)胞提前進(jìn)行了一次破壞，所以后續(xù)粗暴操作效果就沒(méi)那么明顯了。當(dāng)然，也有可能是上述兩種原因共同作用的結(jié)果，如果具體到哪種因素更重要，就需要應(yīng)用新鮮采集的血樣進(jìn)行測(cè)試了。至少，我們現(xiàn)在可以比較有把握地回答用戶的疑惑了：細(xì)菌DNA提取的效果還是能代表血液DNA提取的效果的，只不過(guò)差異沒(méi)有那么明顯。如果用冷凍過(guò)的血液樣本提取DNA的時(shí)候，溫和操作獲得DNA的效率會(huì)比劇烈操作獲得DNA的效率降低一半。所以使用Simgen全血DNA小量試劑盒提取DNA的時(shí)候，請(qǐng)忘掉謹(jǐn)慎小心之類(lèi)的警告，相反的越粗暴操作，DNA的提取效率越高！
