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提取DNA應該粗暴還是溫柔?

作者:新景實驗室
版權說明:本文系原創文章 轉載請標注出處和本文鏈接

之前有個客戶投訴說我們的全血DNA小量試劑盒提取的血液DNA濃度很低,效果不好。小新感覺很奇怪,全血DNA小量試劑盒是我們的明星產品,采用專利技術方法提取的血液DNA,比市場上的血液DNA提取試劑盒操作更加簡便,加上樣本用量大,提取同一個血樣的時候,DNA濃度通常只會更高----于是小新立刻與客戶進行了溝通,經過詳細詢問才發現原來客戶之前經常提取質粒DNA,這次提取血液時怕劇烈操作會弄斷基因組DNA,因此沒有按照說明書寫的劇烈操作,而是溫和地操作為了驗證是否是這個原因導致提取的DNA濃度低,小新決定實際測試一下。由于Simgen細菌DNA試劑盒同樣采用了全血DNA小量試劑盒的專利技術提取基因組DNA,小新決定先用細菌樣本測試一下

實驗目的:

測試細菌DNA試劑盒提取過程中劇烈操作與溫和操作對實驗結果的影響。

實驗材料:

過夜培養的DH5α細菌、細菌DNA試劑盒(Simgen Cat. No.3302050

旋渦震蕩器(越新儀器,XH-C

臺式離心機(eppendorf Centrifuge 5415 D

超微量分光光度計(Simgen Cat.No.sim100

電泳儀(北京六一儀器廠,DYY-6C型 )

實驗內容:

劇烈操作

溫和操作

1. 1.5 ml離心管收集3 ml細菌培養物,加入200 μl Buffer TE旋渦震蕩充分懸浮細菌。

2. 加入100 μl溶菌酶溶液,旋渦震蕩15秒混勻37水浴30分鐘。

3. 加入225 μl Buffer L1,旋渦震蕩30秒。

4. 加入225 μl Buffer L2劇烈搖晃離心管3~5次,再旋渦震蕩30秒混勻。

4.  加入225 μl Buffer L2溫和的上下顛倒混勻30秒。

5. 13000 rpm離心2分鐘。

6. 將步驟5中的上清液倒入到核酸純化柱中(核酸純化柱置于2 ml離心管中),蓋上管蓋,12000 rpm離心30秒。

7. 2 ml離心管中的濾液,將核酸純化柱置回到2 ml離心管中,在核酸純化柱中加入500 μl Buffer WA, 蓋上管蓋,12000 rpm離心30秒。

8. 2 ml離心管中的濾液,將核酸純化柱置回到2 ml離心管中,在核酸純化柱中加入600 μl Buffer WB, 蓋上管蓋,12000 rpm離心30秒。

9. 2 ml離心管中的濾液,將核酸純化柱置回到2 ml離心管中,14000 rpm離心1分鐘。

10. 2 ml離心管,將核酸純化柱置于一個潔凈的1.5 ml離心管中,在純化柱中央加100 μl 37℃溫育的Buffer TE,蓋上管蓋,室溫靜置1分鐘,12000 rpm離心30秒。

11. 洗脫下來的DNA測量濃度并進行電泳檢測。

實驗結果:

1. 在超微量分光光度計上用Buffer TE調零,測量提取的DNA,結果如下:

 

 

2. 1%的瓊脂糖凝膠上,加入5 μl提取到的DNA,電泳30 min,結果如下:

實驗討析: 

1. 從超微量分光光度計測量的結果上可以看出,劇烈操作提取的DNA濃度是溫和操作提取的4倍以上Abs260/280幾乎沒有差別,而Abs260/230值劇烈操作提取的DNA更好 。

2. 從電泳圖上可以看到,兩種操作方法提取的DNA電泳的位置差不多,劇烈操作提取的DNA的亮度要明顯亮于溫和操作提取的DNA,與分光光度計測得的數據有較好的對應關系。

大腸桿菌的基因組DNA長度是4.7×106bp,也就是說有接近5000kb的長度,這么長的DNA非常容易斷裂僅僅是用移液器吸取一下DNA溶液就會對DNA有一個剪切的作用)更不用說比細菌基因組DNA更長的人類基因組DNA這種斷裂在整個提取過程中都是無法避免的,這就是為什么我們提取到的基因組DNA片段一般都集中在30-50kb的緣故

Simgen細菌DNA試劑盒沒有使用蛋白酶K消化蛋白,所以更需要劇烈的操作步驟使DNA和蛋白質分離開,否則基因組DNA就伴隨著沉淀物丟失了。我們從電泳圖中也可以發現,溫和操作獲得的基因組DNA長度沒有比劇烈操作獲得的基因組DNA更長;劇烈操作獲得的基因組DNA也沒有非常嚴重的拖尾現象。因此建議大家在提取DNA的過程中一定要按照試劑盒說明書上的要求操作,如果遇到懷疑或不理解的操作步驟可以先和技術支持溝通一下,千萬不要想當然地去更改操作方法,否則結果可能是適得其反。

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