實測植物總RNA提取液套裝提取土豆、桑葉中的RNA

一直以來，搞植物研究的同學們對Trizol試劑提取植物RNA詬病不斷，在這樣的背景和需求下，我們特別研發了植物總RNA提取液套裝，套裝中除了植物總RNA提取液外，還包括了Buffer EX(氯仿替代品)，RNA沉淀液（異丙醇替代品）以及β-巰基乙醇。真可謂一個套裝在手，提取植物RNA無煩惱！現在我們特別選擇了土豆塊莖（Trizol試劑提取失敗）和桑葉（Trizol試劑提取效率極低）兩個典型樣本實測植物總RNA提取液套裝的效果。

一、實驗目的：

用植物總RNA提取液套裝從桑葉和土豆塊莖中提取RNA。

二、實驗材料：

桑樹葉片、土豆塊莖，研缽，植物總RNA提取液套裝（Simgen Cat. No.5123100）

超微量電子天平（DENVER INSTRUMENT，TP-213）

旋渦震蕩器（越新儀器，XH-C）

臺式離心機（eppendorf Centrifuge 5415 D）

超微量分光光度計（Simgen Cat.No.sim100）

電泳儀（北京六一儀器廠，DYY-6C型 ）

土豆內參引物（F：ATTGGAAACGGATATGCTCCA/R：TCCTTACCTGAACGCCTGTCA）

2×One Step SYBR Green RT-qPCR Mix（Simgen Cat. No.7405500）

熒光定量PCR儀（ABI7500）

三、實驗內容：

1. 在研缽中加入約300 mg小塊的土豆塊莖或桑樹葉片，加入1.8 ml已加入β-巰基乙醇的植物總RNA提取液，然后用研磨棒進行研磨，直至組織呈勻漿狀。

2. 吸取700 μl混合液分裝到兩個1.5 ml離心管中（備注：在植物總RNA提取液套裝說明書中步驟1、2要求將植物樣本經液氮磨成粉末狀后再按每管100 mg的量分裝到1.5 ml離心管中，每管再加入600 μl含β-巰基乙醇的植物總RNA提取液）。

3. 加入600 μl Buffer EX，用力混合均勻，13000 rpm離心10分鐘。

4. 小心吸取350 μl上清，轉入一個潔凈的1.5 ml離心管中。

5. 在上清液中加入等體積的RNA沉淀液，蓋上管蓋混合均勻，13000 rpm離心5分鐘。

6. 棄上清，低速離心數秒使管壁上的上清液聚集到管底，用200 μl吸頭吸盡殘留的上清液。

7. 加入1 ml 70%乙醇，蓋上管蓋，旋渦震蕩懸浮RNA沉淀，13000 rpm離心3分鐘。

8. 棄上清，蓋上管蓋，低速離心數秒使管壁上的乙醇沉降到管底，用200 μl吸頭吸盡殘留的乙醇，保留管底及管壁的白色RNA沉淀。室溫靜置5分鐘干燥RNA。

9. 根據RNA沉淀量加入適量RNase-free水（土豆塊莖樣本50 μl，桑葉樣本200 μl）旋渦震蕩溶解RNA，在超微量分光光度計上測量RNA的濃度，然后進行瓊脂糖凝膠電泳。

按照2×One Step SYBR Green RT-qPCR Mix的說明書操作，對提取到的土豆RNA進行熒光PCR擴增。

四、實驗結果：

1. 在微量分光光度計上用RNase-Free Water調零，測量提取好的RNA，結果如下：

1、2是土豆使用植物總RNA提取液套裝所獲得的總RNA；3、4是桑葉使用植物總RNA提取液套裝所獲得的總RNA。

2. 在1%的瓊脂糖凝膠上，加入5 μl提取到的RNA，電泳20 min，結果如下：

1、2條帶是土豆RNA電泳結果；3、4條帶是桑葉RNA電泳結果，M是DL2000 Marker。

3、土豆RNA熒光PCR曲線圖

五、實驗討論與分析：

1. 從微量分光光度計測的結果上分析，使用Simgen植物總RNA提取液套裝，不論是土豆塊莖還是桑葉都獲取到了純度非常高的RNA。通常Trizol試劑提取的RNA會出現的A260/A230值偏低的情況也沒有出現。

2. 從電泳圖上分析，RNA條帶完整，有不明顯的基因組DNA污染（土豆RNA）或者根本就觀察不到基因組DNA污染（桑葉RNA），與分光光度計測得的數據有較好的對應關系。

3. 從熒光PCR結果上分析，擴增曲線正常，無抑制現象。

綜上所述，植物總RNA提取液套裝是與Trizol試劑完全不同的產品，不僅不涉及酚氯仿的使用，而且非常適合從高多糖多酚的植物樣本中提取RNA。除此之外，植物總RNA提取液套裝不僅操作步驟比Trizol試劑更為簡單方便，同時又與Trizol試劑一樣，對樣本的用量沒有限制，非常適合一次需要提取非常大量RNA的用戶使用。