Carrier RNA的存在對血漿游離核酸純化效率的影響

實驗目的：在實驗中設計Carrier RNA的添加與否以探究其對小片段核酸純化的回收效率的影響。

實驗材料及設備：

血漿游離核酸純化試劑盒（simgen）、Carrier RNA(simgen)、人血漿（購自浙江省血液中心）、無水乙醇、動物源性檢測試劑盒（豬源）（simgen）

樣本：豬源的擴增產物（引物Forward CGACAAAGCAACCCTCACAC；引物Reverse TGCGAGGGCGGTAATGAT長度為70 bp）用Buffer TE稀釋10000倍后，再用人血漿稀釋1000倍作為含有游離核酸的血漿樣本。

設備：ABI 7000 熒光PCR儀、漩渦震蕩儀、水浴鍋、離心機及移液器

其他耗材：1.5ml離心管、八連排PCR管，RNase-free吸頭，一次性手套及防護用品和紙巾。

實驗方法：

1、  根據simgen血漿游離核酸純化試劑盒的說明書的操作步驟，按照下列方案進行操作，提取DNA。

注：編號1─4為體液為200 μl時，且在Carrier RNA加與不加時對擴增的影響，同時將體液樣品擴大4倍即編號5─8，探究Carrier RNA加與不加的影響。

2、  用simgen的動物源性檢測試劑盒（豬源）配制PCR混合液，將取得的8管DNA按照5 μl/管加入到PCR反應體系混合液中，進行熒光PCR擴增，觀察實驗結果。

實驗結果：

杭州新景生物實驗圖2、800ul體液樣本的擴增曲線

討論與分析：

1. 從圖1分析：加入Carrier RNA的1號和2號CT值比3號小約1.5個CT值；比4號小約3.5個CT值。說明該核酸純化體系中，如果不含Carrier RNA，痕量核酸的回收效率會變得不穩定，是加入Carrier RNA的核酸純化體系回收效率的1/10—1/3。

2. 從圖2分析：加入Carrier RNA的5號和6號CT值比7號和8號小約3.3個CT值。說明該核酸純化體系中，如果不含Carrier RNA，則會是加入Carrier RNA的核酸純化體系回收效率的1/10左右。

3. 小片段（本實驗是70bp）痕量DNA（pg級別）用柱純化回收的過程中，CarrierRNA的加入，能顯著提高回收效率。

杭州新景生物實驗室

2015年11月10 日