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實測simgen糞便DNA保存液的保存時效

作者:新景實驗室
版權說明:本文系原創文章 轉載請標注出處和本文鏈接

糞便DNA保存液作為Simgen的熱銷產品深受用戶喜愛,咨詢的客戶也很多,之前就有客戶問到產品介紹中描述的糞便樣本中的DNA經糞便保存液穩定后可在室溫(15-25℃)保存6個月以上而免于降解有沒有具體的數據資料。當時分光光度計的檢測數據有記錄,但是電泳圖并沒有保存,而且當時取樣量不多,只做了26周測試,后面就因為樣本不夠而無法繼續進行下去了。為了提供完整可信的實驗數據以及探究糞便DNA能不能保存更久的時間,小新采集了樣本進行了糞便DNA保存液保存效果的長期測試。

 

實驗目的:

測試糞便DNASimgen糞便DNA保存液中長時間保存的效果。

 

實驗材料:

新鮮采集的人糞便、糞便DNA保存液(Simgen Cat.No.4103050)、糞便DNA純化試劑盒(配套糞便DNA保存液)(Simgen Cat.No.4111050

超微量電子天平(DENVER INSTRUMENTTP-213

旋渦振蕩器(越新儀器,XH-C

電熱恒溫培養箱(上虞市滬越儀器設備廠,DHG 303-0

電子恒溫不銹鋼水浴鍋(上海宜昌儀器紗篩廠)

臺式離心機(eppendorf Centrifuge 5415 D

超微量分光光度計(Simgen Cat.No.sim100

電泳儀(北京六一儀器廠,DYY-6C型 )

 

實驗方法:

小新于2022919日采集了5 g糞便樣本,加入了10 ml糞便DNA保存液,旋渦振蕩直至糞便顆粒全部分散溶解后,置于37℃恒溫箱保存至今(除了過年和十一長假,其他時間恒溫箱一直開啟),期間每隔一段時間提取一次DNA

 

DNA提取操作步驟如下:

1. 將吸頭尖端剪掉,從糞便DNA保存液保存的糞便樣本中吸取100 μl懸濁液,轉移到自備的1.5 ml離心管中。

2. 加入350 μl 70℃溫育的Buffer HST,蓋上管蓋,混合均勻,70水浴5分鐘。

3. 12000 rpm離心1分鐘。

4. 吸取20 μl蛋白酶K貯存液,加入到一個1.5 ml離心管管底。

5. 吸取200 μl步驟3中的離心上清加入到該1.5 ml離心管中。

6. 加入200 μl Buffer SL旋渦振蕩約15秒混勻。將離心管置于70℃水浴10分鐘。

7. 加入200 μl無水乙醇,溫和地翻轉4~6次混和均勻低速離心數秒使管蓋上的溶液沉降到管底。

8. 吸取步驟7中的混合液加入到核酸純化柱中(核酸純化柱置于2 ml離心管中),蓋上管蓋,離心棄濾液。

9. 依次用500 μl Buffer WA600 μl Buffer WB洗滌純化柱。

10. 高速空離去除殘留液體。

11. 2 ml離心管,將核酸純化柱置于一個潔凈的1.5 ml離心管中,在純化柱的膜中央加入150 μl 70℃溫育的Buffer TE,蓋上管蓋,室溫靜置1分鐘,離心得到DNA

 

實驗結果:

1、在超微量分光光度計上用試劑盒內的Buffer TE調零,測量洗脫下來的DNA,結果如下:

simgen-糞便DNA保存液-糞便DNA純化試劑盒(配套糞便DNA保存液)-測量洗脫下來的DNA結果

2、1%的瓊脂糖凝膠上,加入5 μl洗脫的DNA進行電泳,結果如下:

simgen-糞便DNA保存液-糞便DNA純化試劑盒(配套糞便DNA保存液)-在1%的瓊脂糖凝膠上,加入5 μl洗脫的DNA進行電泳結果


分析與討論:

1. 糞便樣本經糞便DNA保存液處理后,置于37℃保存至今已達16個月,從分光光度計測量結果來看,每次均成功提取到了DNA,不過濃度略有跳動,總體趨勢似乎放得越久濃度越高

2. 經過電泳檢測分析,當天提取的糞便DNA濃度偏高,應該是由于樣本剛采集,提取到的糞便DNA中混有一些降解的RNA提高了OD260的吸收值,這與OD260/OD280的比值接近2.0也有對應關系。

3. DNA提取的濃度隨糞便樣本室溫放置的時間延長濃度有升高現象,這是出乎意料的結論。經過認真分析我們認為是以下三個原因所導致:

1) 糞便DNA保存液保存糞便DNA的過程中在緩慢地溶解細菌,隨著時間的延長,釋放到保存液中的DNA就越多,在后續提取DNA的離心步驟(步驟3)中被沉淀丟失的DNA就會越少,顯示出DNA的回收量就越高。

2) 37℃存放的條件下,釋放到糞便DNA保存液中的DNA還是會緩慢地分解的:這個從電泳分析圖中就可以觀察到,存放1~4個月的樣本中提取的DNA拖尾做少,在存放5~16個月的樣本中提取的DNA中,比較明顯的拖尾就觀察到了。DNA的片段越小,相對而言OD260的吸收值就越高,造成了提取的DNA濃度偏高的假象。

3) 最后我們發現,隨著37放置時間的延長,水分會有部分被蒸發這就相當于糞便DNA保存液被濃縮了,這很可能是16個月存放的樣本提取到的DNA濃度有明顯提高的主要原因

4. 好消息就是:Simgen糞便DNA保存液保存的糞便,在為期16個月的測試中,糞便DNA雖然產生了一些拖尾,但是基因組DNA的主條帶依舊清晰可見,無需擔心后續的分子生物學實驗應用

綜上所述,我們可以得出結論,糞便樣本中的DNASimgen糞便DNA保存液穩定后至少可在37℃保存16個月而免于降解。如果將該樣本存放到2~8℃,毫無疑問疑問保存時間可以延長到2~3年。至于加了Simgen糞便DNA保存液的糞便樣本在常溫是否還能保存更久,小新會將測試繼續下去,敬請期待。




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