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為什么我的凝膠DNA回收率低(--續(xù))

作者:新景實驗室
版權說明:本文系原創(chuàng)文章 轉(zhuǎn)載請標注出處和本文鏈接

 近日來,公司再次接到凝膠回收效率低的反饋經(jīng)過深入探究客戶反映的問題,小編發(fā)現(xiàn)很多用戶都是將擴增產(chǎn)物直接測濃度后估算回收效率的,并且回收的DNA濃度也各不相同,于是設計一系列相關模擬實驗,如下

用于回收DNA的樣本

1. 陳舊細菌細胞中提取的pMD18 酶切產(chǎn)物,含部分降解的DNA,用以模擬含有部分引物二聚體或有非特異擴增的PCR擴增產(chǎn)物,如下圖

  

2. 經(jīng)過DNA純化試劑盒(Simgen Cat.No. 2101050)純化后的陳舊細菌細胞中提取的pMD18 酶切產(chǎn)物

3. 正常pMD18酶切產(chǎn)物,只有單條帶的DNA,用以模擬只有特異性擴增的PCR產(chǎn)物;

4. 經(jīng)過DNA純化試劑盒(Simgen Cat.No. 2101050)純化后的正常pMD18 酶切產(chǎn)物

實驗設備:

臺式小量離心機、水浴鍋、電泳設備、恒溫培養(yǎng)箱、Sim-100微量紫外分光光度計

實驗方法

此實驗分兩批進行:

第一批是陳舊細菌細胞中提取的pMD18 酶切產(chǎn)物及其純化產(chǎn)物為樣本,

第二批是正常pMD18 酶切產(chǎn)物及其純化產(chǎn)物為樣本。

將酶切產(chǎn)物及酶切純化產(chǎn)物按2μg1μg500ng100ng上樣量電泳后做DNA凝膠回收(試劑盒為Simgen Cat.No. 2001050)實驗。實驗組分A組(純化前酶切產(chǎn)物)、B組(純化后酶切產(chǎn)物),C組(對照組,按B組設計的DNA加入量,與150μl融化的瓊脂糖凝膠混合,冷卻凝固后作為無損失的含DNA凝膠塊)。

樣本電泳加樣順序:


ABC 三組按照凝膠DNA回收試劑盒說明書進行操作,所回收的DNA25μl Buffer TE洗脫,并測OD值。

實驗測試結果如下:


從上表結果可分析得到:

1.  100 ng上樣量的回收率有很大跳動,甚至有的看似回收率超過100%,估計是因為在DNA濃度過低(<10ng/μl)時,分光光度計測到的OD值會出現(xiàn)很大的偏差,因此100 ng上樣量測得的回收率不能作為有效的分析數(shù)據(jù)。

2.  實驗組中拖尾pMD18酶切產(chǎn)物的回收率均低于正常pMD18酶切產(chǎn)物,可以解釋為陳舊樣本中所含的小片段降解DNA,在切膠時這些拖尾帶未被切下,造成了DNA的損失;

3.  實驗組中純化前樣本的回收率均低于純化后樣本。是因為酶切后溶液中有組份(比如水解后的單核苷酸)提高了OD260的吸光度,因而純化后的DNA樣本的OD260的吸光度更為真實。




    

最后我們可以得出結論:

1. OD260的吸收值來判定凝膠DNA回收試劑盒的回收效率并不科學,因為有很多因素會影響OD值,如PCR體系中的多余引物、dNTPS及非特異擴增產(chǎn)物等。

2. 如果要精確測試凝膠DNA回收試劑盒回收效率,應先確保DNA樣本中沒有其他雜質(zhì)或核酸干擾OD260的吸收值。

3. DNA上樣量不能過低,如果有可能,應將全部的PCR擴增產(chǎn)物上樣電泳,否則分光光度計在測試10ng/μl以下濃度的核酸時,計算回收率時會出現(xiàn)嚴重的偏差。



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