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唾液樣本不加保存液能在室溫存放多久

作者:新景實驗室
版權說明:本文系原創文章 轉載請標注出處和本文鏈接

前段時間有客戶詢問唾液采集后在不加保存液的情況下唾液中的DNA可以在室溫放多久而不降解為了解答客戶的疑問,于是小新測試了唾液在室溫放置不同時間段提取DNA效果情況,以及唾液與唾液保存液混合后在不同時間段提取DNA的效果。

一、實驗目的

測試唾液樣本在室溫放置不同時間對唾液DNA的影響及唾液保存液對唾液中DNA的保存效果


二、實驗材料

1. 新鮮采集的人唾液、1. 5 ml離心管若干、2 ml離心管若干

2. 唾液DNA純化試劑盒(Simgen Cat.No.3501050唾液DNA保存液(Simgen Cat.No.3522050

3. 臺式離心機(eppendorf centrifuge 5415D)、旋渦振蕩器(越新儀器,XH-C)、超微量分光光度計(Simgen Cat.No.sim-100、電泳儀(北京六一儀器廠,DYY-6C型)

 

三、 實驗方法

整個實驗溫度波動范圍22~28

1. 用潔凈的一次性水杯收集唾液:

1a. 轉移400 μl唾液到一個潔凈的1.5 ml離心管中(分別在室溫放置0小時、0.5小時、1小時、1.5小時、4小時、7小時以及24小時),加入400 μl Buffer L5,劇烈搖晃離心管35次,再旋渦振蕩30秒混勻。最高速(≥12000 rpm)離心1分鐘。

1b. 轉移400 μl唾液到一個潔凈的2 ml離心管中,再加入400 μl唾液DNA保存液混合均勻(分別在室溫放置4小時、7小時以及24小時),加入800 μl Buffer L5,劇烈搖晃離心管35次,再旋渦振蕩30秒混勻。最高速(≥12000 rpm)離心1分鐘。

2. 將步驟1中的離心上清液倒入核酸純化柱中(核酸純化柱置于2 ml離心管中)(步驟1b中的上清液分兩次濾過核酸純化柱),蓋上管蓋,12000 rpm離心30秒。

3. 2 ml離心管中的濾液,將核酸純化柱置回到2 ml離心管中,在核酸純化柱中加入700 μl Buffer WA,蓋上管蓋,12000 rpm離心30秒。

4. 2 ml離心管中的濾液,將核酸純化柱置回到2 ml離心管中,在核酸純化柱中加入800 μl Buffer WB,蓋上管蓋,12000 rpm離心30秒。

5. 2 ml離心管中的濾液,將核酸純化柱置回到2 ml離心管中,13200 rpm離心2分鐘。

6. 2 ml離心管,將核酸純化柱置于一個潔凈的1.5 ml離心管中,在純化柱的膜中央加入80 μl Buffer TE,蓋上管蓋,室溫靜置2分鐘,12000 rpm離心30秒得到唾液DNA

 

四、 實驗結果

1. 在超微量分光光度計上用Buffer TE調零,測量洗脫下來的DNA,結果如下:

表一

Simgen在超微量分光光度計上用Buffer TE調零測量洗脫下來的DNA結果圖一

表二

Simgen在超微量分光光度計上用Buffer TE調零測量洗脫下來的DNA結果圖二

* 標識成藍色字體的是唾液樣本與唾液DNA保存液混合后在室溫放置不同的時間提取DNA獲得的數據。

 

2. 1%的瓊脂糖凝膠上加入5 μl洗脫的唾液DNA進行電泳,結果如下:

圖一

Simgen在1%的瓊脂糖凝膠上加入5 μl洗脫的唾液DNA進行電泳結果圖一

12:新鮮采集的唾液立刻提取的DNA

34:采集的唾液室溫放置0.5小時提取的DNA

56:采集的唾液室溫放置1小時提取的DNA

78:采集的唾液室溫放置1.5小時提取的DNA

 

         圖二

Simgen在1%的瓊脂糖凝膠上加入5 μl洗脫的唾液DNA進行電泳結果圖二

910采集的唾液室溫放置4小時提取的DNA

1112采集的唾液混合保存液室溫放置4小時提取的DNA

1314:采集的唾液室溫放置7小時提取的DNA

1516:采集的唾液混合保存液室溫放置7小時提取的DNA

1718:采集的唾液室溫放置24小時提取的DNA

1920:采集的唾液混合保存液室溫放置24小時提取的DNA

  圖三

Simgen在1%的瓊脂糖凝膠上加入5 μl洗脫的唾液DNA進行電泳結果圖三Simgen在1%的瓊脂糖凝膠上加入5 μl洗脫的唾液DNA進行電泳結果圖四

Marker1 kb DNA Ladder

左圖:唾液采集后與唾液DNA保存液混合后當天提取的唾液DNA

右圖:唾液采集后與唾液DNA保存液混合室溫放置一年后提取的唾液DNA

                 

五、 分析與討論

1. 綜合表一和表二的數據我們發現,如果直接取唾液樣本提取DNA,隨著唾液在室溫放置時間的延長,DNA的提取濃度出現了先增高(0~1小時)后降低(1~24小時)的現象。結合圖一和圖二的電泳圖我們可以發現,唾液中提取到的DNA均有明顯的凋亡細胞DNA的特征,即DNA拖尾的帶型與DNA Ladder相似。這就說明了唾液中DNA的主要來源是脫落的口腔上皮細胞,這些細胞大多數已經死亡,細胞核中的染色體結構正處于分崩離析的過程中。

2. 結合不同時間段提取的DNA電泳帶型分析,我們發現唾液樣本直接提取的DNA中大片段DNA(主帶)隨著時間的延長越來越暗,小片段DNA則亮度先增加(見泳道13,14,室溫存放7小時達到最亮)后減少。這說明有一些尚未明確的原因,比如口腔上皮細胞的自溶過程,或者是唾液中細菌滋生的一些因素導致唾液收集后其中的大片段DNA一直在持續地斷裂分解成小片段DNA,這些小片段DNA24小時后大部分都已經吸附不到DNA純化柱上了(見泳道1718)。這個分解過程在1小時內對提高DNA的提取效率可能是有正向作用的(參考文章提取DNA應該粗暴還是溫柔?),但是超過1.5小時后就能明顯地發現DNA提取量在迅速地減少。

3. 從表二的數據我們發現唾液與唾液保存液混合后4小時、7小時、24小時后提取到的DNA濃度變化不大,與不加保存液的唾液DNA的提取結果形成了鮮明對比,驗證了唾液DNA保存液對唾液DNA的保存效果

4. 最后我們可以明確地回答用戶的提問了:唾液樣本收集后,DNA馬上就開始降解了(或者更精確的描述應該是上皮細胞死亡后DNA就開始分解了),所以如果沒有唾液DNA保存液,收集的唾液樣本必須在1小時內放入﹣20℃冰箱或更低溫度冷凍儲藏。室溫存放的唾液DNA降解速度大致情況是4小時后分解掉50%數量的DNA24小時后分解掉90%數量的DNA

5. 如果收集的唾液和唾液DNA保存液混合后再存放室溫,提取到的DNA則非常穩定,電泳顯示的帶型(見圖二)也沒有明顯的變化。實際上,我們曾實測過唾液與唾液DNA保存液混合后室溫放置一年后提取唾液DNA的效果,從電泳上看,一年后提取的DNA帶型與當天提取的DNA帶型差別也不是很明顯(見圖三)即唾液樣本經唾液DNA保存液處理后能在常溫放置12個月以上DNA沒有明顯的降解

 

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