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微量DNA 提取方法

作者:新景實驗室
版權說明:本文系原創文章 轉載請標注出處和本文鏈接

 1、快速微量提取法

1. 1.5ml菌體培養物于一滅菌Ep管中,12000rpm離心1min 丟去上清夜,收集菌體。

2. 加入400μl裂解液(40mMTris-醋酸,20mM醋酸鈉,1mMEDTA1%SDSpH7.8)混勻,置于37水浴1h

3. 然后加入200 μl  5 mol/L的氯化鈉溶液,混勻后于13000rpm離心15min

4. 取上清液,用苯酚抽提2次,氯仿抽提1次。

5. 2倍體積無水乙醇,1/10體積醋酸鉀(3M pH8.0)-20保存1小時后,13000rpm離心15min,棄上清液,沉淀用70%乙醇洗2次;置于室溫干燥后,溶于50μlTE溶液中,置4保存備用。

 

2、加熱去蛋白法提取基因組DNA

試劑:

裂解液:10.95g蔗糖5ml 0.1 mmol/L MgCl22ml 0.5mmol/LTris·HCl (pH7.5),1ml TritonX-100,加滅菌雙蒸水至,100ml;提取液:10ml 0.5 mmol/L KCl 2.5ml 0.1mol/L MgCl22ml 0.5mmol/LTris·HCl(pH8.3),0.45ml NP-40,0.45mlTween-20,加滅菌雙蒸水至100ml;蛋白酶K20mg/ml(貯存液);TE緩沖液(pH8.0),0.2ml 0.5mmol/L EDTA pH8.0),加水至100ml

基因組DNA的提取

抗凝全血0.5ml加等量的裂解液,顛倒混勻后,4放置30min,離心3000rpm10min,棄上清;用0.2ml提取液懸浮沉淀,加入10μl蛋白酶K20mg/ml),顛倒混勻后,55水浴60min,沸水浴中保溫10min;離心12000rpm20min 后,小心吸取上清上清中加入2.5倍體積的冷無水乙醇,顛倒混勻后,-20靜置30min,離心12000rpm20min,棄去水相;沉淀用75%冷乙醇洗滌2次,同上離心,10min,棄去上清;在超凈工作臺中空氣干燥10min,溶于20μl緩沖液中-20保存。

 

3、碘化鈉法(參照Loparev等法加以改良)提取基因組DNA

試劑

6mmol/L碘化鈉溶液:1.5g Na2SO3溶于80滅菌水中,加入90g NaI,溶解后定容至100ml;氯仿;異丙醇;TE緩沖液(pH8.0

基因組DNA的提取

抗凝全血0.5ml加等量的無菌水0.5ml顛倒混勻;加6mmol/L NaI 1ml,渦旋震蕩30s;加等體積氯仿/異丙醇(24:1)混勻;412000rpm 離心10min,小心吸取上清;加0.6倍體積異丙醇混勻;室溫(或4)靜置15min412000rpm離心,10min,棄去上清;沉淀用37%異丙醇洗1次,在超凈工作臺干燥,溶于20μl TE緩沖液中,-20保存。

 

4TTTritonX-100Tris-HCl等混合液的總稱)溶血法提取基因組DNA

試劑

裂解液:10.95g蔗糖5ml 0.1 mmol/L MgCl22ml0.5mmol/L Tris·HCl(pH7.5),1ml TritonX-100,加水至,100ml;提取液:10ml 0.5 mmol/L KCl 2.5ml0.1mol/L MgCl22ml 0.5mmol/LTris·HCl(pH8.3),0.45mlNP-40,0.45ml Tween-20 ,加水至100ml;蛋白酶K 20mg/ml(貯存液);Tris平衡液;氯仿;TE緩沖液(pH8.0)。

基因組DNA的提取

抗凝全血0.5ml加等量的裂解液,顛倒混勻后,4放置30min;離心3000rpm10min,棄上清;用0.2ml提取液,10μl蛋白酶K儲存液懸浮沉淀,顛倒混勻后,55水浴66min;加等體積Tris平衡酚/氯仿(11)顛倒混勻后,離心12000rpm10min;小心吸取上清,加入2.5倍體積的冷無水乙醇,顛倒混勻后,-20靜置30min;離心12000rpm10min,棄去水相;沉淀用75%冷乙醇洗滌兩次,同上離心10min棄去上清;在超凈工作臺中空氣干燥10min,溶于20μl緩沖液中,-20保存。

 

5、氯化胺法提取基因組DNA

試劑

10×紅細胞裂解液:8.29h NH4Cl1.0g KHCO30.037g EDTA,加水至100ml;白細胞裂解液:0.5ml 2mmol/L TrispH8.2),10ml 4mmol/L NaCl0.4ml 0.5mmol/L EDTA,加水至100ml10%W/VSDS;蛋白酶K20mg/ml(貯存液)Tris平衡酚;氯仿;TE緩沖液(pH8.0

基因組DNA的提取

抗凝全血0.5ml2倍的1×紅細胞裂解液,顛倒混勻后,冰上靜置30min直至溶液變透明;離心3000rpm10min棄上清;加300μl白細胞裂解液,顛倒混勻,加30μl 10%W/V),的SDS顛倒混勻;直到出現粘稠透明狀為止;加10μl蛋白酶K儲存液,顛倒混勻后,55水浴60min,加等體積Tris平衡酚/氯仿(11)顛倒混勻后,離心12000rpm10min;小心吸取上清,加入2.5倍體積的冷無水乙醇,顛倒混勻后,-20靜置30min;離心12000rpm10min,棄去水相;沉淀用75%冷乙醇洗滌兩次,同上離心10min,棄去上清;在超凈工作臺中空氣干燥10min,溶于20μl TE緩沖液中,-20保存。


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