1、快速微量提取法
1. 取1.5ml菌體培養物于一滅菌Ep管中,12000rpm離心1min, 丟去上清夜,收集菌體。
2. 加入400μl裂解液(40mMTris-醋酸,20mM醋酸鈉,1mMEDTA,1%SDS,pH7.8)混勻,置于37℃水浴1h。
3. 然后加入200 μl 5 mol/L的氯化鈉溶液,混勻后于13000rpm離心15min。
4. 取上清液,用苯酚抽提2次,氯仿抽提1次。
5. 加2倍體積無水乙醇,1/10體積醋酸鉀(3M ,pH8.0),-20℃保存1小時后,13000rpm離心15min,棄上清液,沉淀用70%乙醇洗2次;置于室溫干燥后,溶于50μlTE溶液中,置4℃保存備用。
2、加熱去蛋白法提取基因組DNA
試劑:
裂解液:10.95g蔗糖5ml 0.1 mmol/L MgCl2,2ml 0.5mmol/LTris·HCl (pH7.5),1ml TritonX-100,加滅菌雙蒸水至,100ml;提取液:10ml 0.5 mmol/L KCl, 2.5ml 0.1mol/L MgCl2,2ml 0.5mmol/LTris·HCl(pH8.3),0.45ml NP-40,0.45mlTween-20,加滅菌雙蒸水至100ml;蛋白酶K20mg/ml(貯存液);TE緩沖液(pH8.0),0.2ml 0.5mmol/L EDTA (pH8.0),加水至100ml。
基因組DNA的提取
抗凝全血0.5ml加等量的裂解液,顛倒混勻后,4℃放置30min,離心3000rpm,10min,棄上清;用0.2ml提取液懸浮沉淀,加入10μl蛋白酶K(20mg/ml),顛倒混勻后,55℃水浴60min,沸水浴中保溫10min;離心12000rpm,20min 后,小心吸取上清’上清中加入2.5倍體積的冷無水乙醇,顛倒混勻后,-20℃靜置30min,離心12000rpm,20min,棄去水相;沉淀用75%冷乙醇洗滌2次,同上離心,10min,棄去上清;在超凈工作臺中空氣干燥10min,溶于20μl緩沖液中-20℃保存。
3、碘化鈉法(參照Loparev等法加以改良)提取基因組DNA
試劑
6mmol/L碘化鈉溶液:1.5g Na2SO3溶于80℃滅菌水中,加入90g NaI,溶解后定容至100ml;氯仿;異丙醇;TE緩沖液(pH8.0)
基因組DNA的提取
抗凝全血0.5ml加等量的無菌水0.5ml顛倒混勻;加6mmol/L NaI 1ml,渦旋震蕩30s;加等體積氯仿/異丙醇(24::1)混勻;4℃。12000rpm 離心10min,小心吸取上清;加0.6倍體積異丙醇混勻;室溫(或4℃)靜置15min;4℃,12000rpm離心,10min,棄去上清;沉淀用37%異丙醇洗1次,在超凈工作臺干燥,溶于20μl TE緩沖液中,-20℃保存。
4、TT(TritonX-100和Tris-HCl等混合液的總稱)溶血法提取基因組DNA
試劑
裂解液:10.95g蔗糖5ml 0.1 mmol/L MgCl2,2ml0.5mmol/L Tris·HCl(pH7.5),1ml TritonX-100,加水至,100ml;提取液:10ml 0.5 mmol/L KCl, 2.5ml0.1mol/L MgCl2,2ml 0.5mmol/LTris·HCl(pH8.3),0.45mlNP-40,0.45ml Tween-20 ,加水至100ml;蛋白酶K 20mg/ml(貯存液);Tris平衡液;氯仿;TE緩沖液(pH8.0)。
基因組DNA的提取
抗凝全血0.5ml加等量的裂解液,顛倒混勻后,4℃放置30min;離心3000rpm,10min,棄上清;用0.2ml提取液,10μl蛋白酶K儲存液懸浮沉淀,顛倒混勻后,55℃水浴66min;加等體積Tris平衡酚/氯仿(1:1)顛倒混勻后,離心12000rpm,10min;小心吸取上清,加入2.5倍體積的冷無水乙醇,顛倒混勻后,-20℃靜置30min;離心12000rpm,10min,棄去水相;沉淀用75%冷乙醇洗滌兩次,同上離心10min棄去上清;在超凈工作臺中空氣干燥10min,溶于20μl緩沖液中,-20℃保存。
5、氯化胺法提取基因組DNA
試劑
10×紅細胞裂解液:8.29h NH4Cl,1.0g KHCO3,0.037g EDTA,加水至100ml;白細胞裂解液:0.5ml 2mmol/L Tris(pH8.2),10ml 4mmol/L NaCl,0.4ml 0.5mmol/L EDTA,加水至100ml;10%(W/V)SDS;蛋白酶K20mg/ml(貯存液)Tris平衡酚;氯仿;TE緩沖液(pH8.0)
基因組DNA的提取
抗凝全血0.5ml加2倍的1×紅細胞裂解液,顛倒混勻后,冰上靜置30min直至溶液變透明;離心3000rpm,10min棄上清;加300μl白細胞裂解液,顛倒混勻,加30μl 10%(W/V),的SDS顛倒混勻;直到出現粘稠透明狀為止;加10μl蛋白酶K儲存液,顛倒混勻后,55℃水浴60min,加等體積Tris平衡酚/氯仿(1:1)顛倒混勻后,離心12000rpm,10min;小心吸取上清,加入2.5倍體積的冷無水乙醇,顛倒混勻后,-20℃靜置30min;離心12000rpm,10min,棄去水相;沉淀用75%冷乙醇洗滌兩次,同上離心10min,棄去上清;在超凈工作臺中空氣干燥10min,溶于20μl TE緩沖液中,-20℃保存。