一、實驗目的

測試不同病毒核酸樣本保存液保存病毒RNA的效果。

二、實驗材料

1. 病毒核酸樣本保存液（Simgen Cat.No.4112100）

2. 市場上常見的含胍鹽的病毒核酸樣本保存液（新景生物研發）

3. 外購對照病毒核酸樣本保存液（取自華越核酸檢測采樣管，揚州華越科技發展有限公司生產，蘇揚械備20150248號）

4. 生理鹽水（Simgen Cat.No.9005500）

5. 新冠假病毒（10⁸ copies/ml）（訂單編號：F1518870，復百澳（蘇州）生物科技有限公司）

6. 新鮮采集的人唾液

7. 病毒核酸純化試劑盒（Simgen Cat.No. 4002050）（產品批號：20211203）

8. 2×One Step Probe RT-PCR Mix（Simgen Cat.No.7406100）（產品批號：20211240）

9. 新冠病毒特異性引物及探針（F：CCCTGTGGGTTTTACACTTAA/R：ACGATTGTGCATCAGCTGA，Probe：5’-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3’）

10. 電熱恒溫培養箱（上海精宏實驗設備有限公司，DNP-9082）

11. 旋渦振蕩器（越新儀器，XH-C）

12. 臺式離心機（eppendorf Centrifuge 5415 D）

13. 熒光PCR儀（ABI 7500）

三、實驗方法

1. 用唾液將假病毒（10⁸ copies/ml）稀釋到10⁶ copies/ml；

2. 將三種病毒核酸樣本保存液及生理鹽水與唾液（含假病毒）按5:1的體積比（1.5ml + 0.3 ml）混合均勻，分別放在37℃和﹣80℃保存；

3. 保存第3天和保存第7天用病毒核酸純化試劑盒提取四種保存液保存的假病毒RNA，提取方法如下：

1) 在1.5 ml離心管中加入20 μl蛋白酶K貯存液，再加入200 μl樣本（保存液與唾液樣本的混合物）。

2) 加入200 μl含Carrier RNA的Buffer VL，旋渦振蕩約15秒混勻。

3) 將離心管置于56℃水浴10分鐘。

4) 加入320 μl無水乙醇，溫和地翻轉4~6次混合均勻。

5) 吸取步驟4）中的溶液加入到核酸純化柱中（核酸純化柱置于2 ml離心管中），蓋上管蓋，12000 rpm離心30秒。

6) 棄2 ml離心管中的濾液，將核酸純化柱置回到2 ml離心管中，在核酸純化柱中加入700 μl Buffer WBR，蓋上管蓋，12000 rpm離心30秒。

7) 棄2 ml離心管中的濾液，將核酸純化柱置回到2 ml離心管中，13200 rpm離心2分鐘。

8) 棄2 ml離心管，將核酸純化柱置于一個潔凈的1.5 ml離心管中，在純化柱的膜中央加入50 μl 56℃預熱的Buffer TE，蓋上管蓋，室溫靜置1分鐘，12000 rpm離心30秒得到病毒RNA。

用2×One Step Probe RT-PCR Mix擴增提取到的病毒RNA，擴增體系如下

實驗參數：50℃ 5 min；95℃ 1 min；（95℃ 10s；60℃ 30s）×40 cycles

四、實驗結果

圖1：第3天擴增曲線圖

表1：第3天擴增結果CT值

圖2：第7天擴增曲線圖

表2：第7天擴增結果CT值

五、分析與討論

1. 根據擴增曲線圖1、圖2及CT值（表1、表2）分析，除了生理鹽水外，其余三種保存液在第三天與第七天時37℃保存和﹣80℃保存結果相似，CT值差異較小。

2. 根據擴增曲線圖1、圖2及CT值（表1、表2）分析，37℃存放7天后，新景病毒核酸樣本保存液（平均CT值25.32）對比含胍鹽的保存液（平均CT值26.10）平均小約0.78個CT值；比生理鹽水（平均CT值27.45）平均小2.13個CT值；對比外購的華越科技的病毒核酸樣本保存液（平均CT值35.18）平均小9.86個CT值。
綜上可以推測出，與新景病毒核酸樣本保存液保存的新冠假病毒對比，生理鹽水保存的新冠假病毒在37℃存放7天后約有80%的假病毒RNA被水解；華越科技的病毒核酸樣本保存液保存的新冠假病毒在37℃存放7天后則有99.9%以上假病毒RNA已經被水解。

3. 根據圖1及表1還可以推測出，在新冠假病毒和病毒樣本保存液混合后，如果病毒樣本保存液中不含滅活RNA酶的蛋白變性劑（比如市場上與生理鹽水同類的非滅活型病毒保存液）的，病毒RNA降解非常迅速，在放入﹣80℃凍存前（操作時間約20分鐘）已經大量水解。

4. 根據表2的數據可以得出結論，新景生物的病毒核酸樣本保存液與假病毒混合后在37℃存放7天的樣本（平均CT值25.32），與同步在﹣80℃保存的樣本（平均CT值24.8）對比CT值變化不大，較市場上常見的含胍鹽保存液（滅活型）（平均CT值26.10）保存病毒RNA的穩定性更高，配套應用于RNA病毒檢測的取樣環節能有效提高檢測的靈敏度。

5. 外購的華越科技的病毒核酸樣本保存液較生理鹽水保存病毒的效果更差，并且在與假病毒混合后即開始降解病毒RNA，說明該病毒核酸樣本保存液含溶解病毒顆粒的試劑組分，但缺少穩定RNA的試劑組分，不能用于病毒RNA樣本的保存。