還記得前段時間偷吃實驗室培養基的真菌嗎？之前小新用植物/真菌DNA試劑盒（Simgen Cat.No.3200050）提取了該真菌的基因組DNA。這次小新用提取的DNA進行了PCR擴增，然后將PCR產物送去基因測序，最后在NCBI上與已知菌種序列進行比對后得出該菌種為曲霉屬（Aspergillus sp.）。下面就跟小新一起回顧一下具體的操作步驟吧。

實驗目的：

鑒定未知真菌菌種。

實驗材料：

1. 樣本：提取好的真菌DNA。

2. 2×PCR Mix（Simgen Cat.No.7003100）、真菌ITS引物（ITS1：5?-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’/ITS4：5?-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3?）和（ITS5：5?-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3?/ITS4：5?-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3?）

3. PCR儀：Techne FPROGO5Y Progene Thermal

4. 電泳儀（北京六一儀器廠，DYY-6C型 ）

5. 相關網址：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/

實驗內容：

1. PCR擴增：

①　將2×PCR Mix、ddH₂O、模板DNA和引物室溫解凍，置于冰上。

②　將解凍后各個組分上下翻轉混合均勻，按下列組成配制PCR反應液：

③　手指輕彈PCR反應管充分混勻，簡短離心。

④　按下方條件設置PCR程序：

94℃，4 min→（94℃，45 s→55℃，45 s→72℃，1 min）×35 cycles→72℃，5 min

2. 對PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

3. 將獲得的PCR擴增產物及引物交由測序公司測序。

4. 在NCBI網站上對比序列，確定真菌菌種。

打開NCBI，選擇BLAST，選擇Nucleotide Blast，在Enter Query Sequence序列框內輸入核苷酸序列，輸入Job Title，在默認條件下BLAST，得到結果。

5. MEGA5堿基序列比對。

打開MEGA5，將菌種的堿基序列輸入，點擊W進行比對，刪除兩端不能比對的堿基序列，將比對結果保存。關閉頁面，在主頁面打開Analysis→Phylogeny→Construct/Test Neighbor-Joining Tree...參數選擇Bootstrap method輸入1000，開始建樹。

實驗結果

1. 凝膠電泳結果：

在1%的瓊脂糖凝膠上，加入5 μl擴增產物、DL2000 DNA Ladder，電泳15分鐘，結果如下：

2. 序列比對結果：

NCBI Nucleotide BLAST結果截圖（部分）如下：

通過MEGA5軟件對未知菌種及其相似菌株核苷酸序列進行比

對，刪除兩側多余的不能比對的序列，對未知菌種及其相似菌株核苷酸序列分別建立系統發育樹，結果如下：

討論與分析

1. 本次真菌鑒定是通過擴增并測序未知菌種的ITS序列，然后與已知真菌ITS序列比較，從而獲得未知真菌的種屬信息。為了提高準確率，使用了兩對引物分別進行擴增、測序和對比。

2. 從電泳圖能看到，兩對引物均擴增出了條帶，且位置差不多，序列對比結果也幾乎一致。根據NCBI BLAST的結果來看，未知菌種應屬于曲霉屬（Aspergillus sp.）。其菌種核苷酸序列與Aspergillus sydowii、Aspergillus versicolor等曲霉屬的菌種核苷酸序列比對結果相似度都很高。

綜上，最終確定了這個偷吃了實驗室培養基的真菌是一種曲霉菌。