前段時(shí)間，有個(gè)客戶投訴說用快速質(zhì)粒DNA小量試劑盒提取的質(zhì)粒DNA濃度低，詢問他細(xì)菌用量的時(shí)候，客戶說出一個(gè)令人震驚的用量——20 ml，明明試劑盒說明書中標(biāo)明的用量是1-5 ml，為什么要使用那么多的細(xì)菌呢？客戶回復(fù)說師兄師姐都是這么做的，她也就這么做了，而且之前師兄師姐做也沒出問題。為了探究加大菌液用量會(huì)有什么影響，小新專門進(jìn)行了以下測(cè)試。

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/span>

測(cè)試用快速質(zhì)粒DNA小量試劑盒分別提取5 ml、10 ml、15 ml和20 ml細(xì)菌時(shí)的效果。

二、實(shí)驗(yàn)儀器及試劑：

儀器：旋渦震蕩器（越新儀器，XH-C）

臺(tái)式離心機(jī)（eppendorf Centrifuge 5415 D）

超微量分光光度計(jì)（Simgen Cat.No.sim100）

電泳儀（北京六一儀器廠，DYY-6C型）

試劑：快速質(zhì)粒DNA小量試劑盒（Simgen,Cat.NO.1005050）

三、實(shí)驗(yàn)方法：

考慮到接種量、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)基體積的不同，最終細(xì)菌濃度也會(huì)有差別，因此本次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了兩次測(cè)試，分別測(cè)試低濃度和高濃度的細(xì)菌。具體操作如下：

1. 用50 ml離心管分別收集過夜培養(yǎng)的細(xì)菌5 ml，10 ml，15 ml，20 ml各兩管，棄盡培養(yǎng)基。加入250 μl已加入RNase A 的Buffer I，充分懸浮沉淀的細(xì)菌。

2. 把懸浮液轉(zhuǎn)移到1.5 ml離心管，加入250 μl Buffer II，溫和并充分地翻轉(zhuǎn)離心管4-6次。

3. 加入350 μl Buffer N8，溫和并充分地翻轉(zhuǎn)離心管直至溶液中殘留的藍(lán)色沉淀全部消失，轉(zhuǎn)變?yōu)榈S色沉淀。

4. 最高速（≧12000 rpm）離心2分鐘。

5. 將核酸純化柱置于2 ml離心管中，將步驟4中的上清液倒入核酸純化柱中，蓋上管蓋，12000 rpm離心30秒。

6. 棄2 ml離心管中的濾液，將核酸純化柱置回到2 ml離心管中，在核酸純化柱中加入800 μl Buffer W2，蓋上管蓋，12000 rpm離心30秒。

7. 棄2 ml離心管中的濾液，將核酸純化柱置回到2 ml離心管中，最高速 （≧12000 rpm）離心1分鐘。

8. 棄2 ml離心管，將核酸純化柱置于一個(gè)潔凈的1.5 ml離心管中，在純化柱的膜中央加入100 μl Buffer E，蓋上管蓋，室溫靜置1分鐘，12000 rpm離心30秒。

9. 棄純化柱，得到質(zhì)粒DNA。 

四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1. 在超微量分光光度計(jì)上用Buffer E調(diào)零，取2 μl洗脫的質(zhì)粒DNA檢測(cè)，記錄各個(gè)波長(zhǎng)的吸光度，得到的數(shù)據(jù)如下：

 2. 在1%瓊脂糖凝膠上，取5 μl質(zhì)粒DNA進(jìn)行電泳，結(jié)果如下：

3. 加入Buffer N8充分中和并離心后的現(xiàn)象如下圖：在1%瓊脂糖凝膠上，取5 μl質(zhì)粒DNA進(jìn)行電泳，結(jié)果如下：

五、分析與討論：

1. 結(jié)合表一和圖一分析可知，當(dāng)細(xì)菌濃度較低時(shí)，細(xì)菌用量在5 ml、10 ml、15 ml時(shí)，隨著細(xì)菌用量的增加，提取的質(zhì)粒DNA確實(shí)增加了，同時(shí)殘留的RNA也相應(yīng)的增加了。但是當(dāng)細(xì)菌用量到達(dá)20 ml時(shí)，提取的質(zhì)粒DNA反而比15 ml時(shí)要少。說明細(xì)菌濃度較低時(shí)，增加細(xì)菌用量，能相應(yīng)獲得更多的質(zhì)粒DNA，但是細(xì)菌用量超出一定范圍后，質(zhì)粒DNA的提取效率反而降低。

2. 結(jié)合表二和圖二分析可知，不管是10 ml細(xì)菌，還是15 ml、20 ml細(xì)菌，提取到的質(zhì)粒DNA均沒有5 ml細(xì)菌多（注意：雖然從分光光度計(jì)上測(cè)得10 ml細(xì)菌提取到的質(zhì)粒DNA濃度較5 ml細(xì)菌的更高，但是電泳并沒有顯示出更高的DNA濃度，所以應(yīng)該是殘留的RNA對(duì)數(shù)據(jù)造成了干擾）。說明細(xì)菌濃度較高時(shí)，超出5 ml的細(xì)菌用量就會(huì)降低最終的質(zhì)粒DNA的提取效率了。

3. 其實(shí)只要我們稍微認(rèn)真思考一下就會(huì)明白，關(guān)鍵因素是每次提取質(zhì)粒DNA時(shí)細(xì)菌菌體的用量，而非細(xì)菌培養(yǎng)物的體積——因?yàn)椴煌乃拗骶⒉煌呐囵B(yǎng)基以及不同的細(xì)菌培養(yǎng)條件下每ml細(xì)菌培養(yǎng)物中的細(xì)菌數(shù)量會(huì)有很大的差異。那么問題來了，我們?cè)趺创_定自己是否使用了合適的細(xì)菌用量呢？首先，我們先要認(rèn)真遵循說明書建議的細(xì)菌用量提取質(zhì)粒DNA，操作至加入Buffer N8中和后離心2分鐘，接著仔細(xì)觀察沉淀的菌體碎片的沉積效果：如果菌體碎片沉積在底部形成一團(tuán)致密的小塊，比如圖三的10 ml 和15 ml，以及圖四的5 ml，都是比較合適的細(xì)菌用量；圖三的5 ml中部分菌體碎片沉淀物貼在了管壁上，這是菌體用量過少的特征，可以適當(dāng)增加菌體的用量。圖三中的20 ml（右側(cè)的那一管），圖四中的10 ml、15 ml和20 ml，產(chǎn)生的菌體碎片沉淀蓬松，不致密，這都是菌體使用量過多的特征，必須減少菌體的用量。

4. 現(xiàn)在我們大致可以推測(cè)出為什么用戶會(huì)用20 ml細(xì)菌提取質(zhì)粒DNA了，或許她的師兄師姐養(yǎng)的細(xì)菌濃度較低，探索出增加細(xì)菌用量可以提高最后質(zhì)粒DNA的濃度，于是就把這一方法教給了她，然而碰巧她用20 ml高濃度的細(xì)菌提取質(zhì)粒DNA時(shí)，問題就產(chǎn)生了。事實(shí)上，后續(xù)用戶聽從我們的建議用5 ml菌液提取質(zhì)粒DNA后，所投訴的問題也就迎刃而解了。

5. 如果從更深層次去分析原因，其本質(zhì)上是細(xì)菌使用量過多時(shí)，溶解細(xì)菌的效率降低，不能被充分溶解破裂的細(xì)菌就不能充分釋放質(zhì)粒DNA，在中和步驟時(shí)大部分的質(zhì)粒DNA仍然被包裹在菌體碎片、變性蛋白及基因組DNA所形成的沉淀物中，導(dǎo)致了質(zhì)粒DNA回收效率過低。   

本次實(shí)驗(yàn)說明了一點(diǎn)，在質(zhì)粒DNA提取的過程中，用多少ml菌液提取質(zhì)粒DNA確實(shí)是可變的，但是一味想著用提高菌液用量的方法來提高質(zhì)粒DNA的濃度卻會(huì)適得其反。當(dāng)然只要我們培養(yǎng)的細(xì)菌每ml所含的質(zhì)粒數(shù)量較多，我們就沒必要老琢磨著用提高菌液用量的方法去獲取更多的質(zhì)粒DNA了，所以我們?cè)僖靡槐檎f明書中關(guān)于細(xì)菌培養(yǎng)的關(guān)鍵內(nèi)容，希望同學(xué)們牢記于心：

(1) 不應(yīng)吸取儲(chǔ)存的甘油菌直接進(jìn)行培養(yǎng)。長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存的甘油菌中的細(xì)菌可能已經(jīng)出現(xiàn)細(xì)菌個(gè)體間基因型的變化，并混有丟失質(zhì)粒的細(xì)菌。甘油菌必須在含有抗生素的平板上劃線篩選，挑選生長(zhǎng)良好的單菌落用于接種培養(yǎng)。

(2) 不要挑取多個(gè)單克隆菌落到一份液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。不同單克隆菌落間可能由于存在基因型差異的原因，相互間有生存競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，反而使收獲的菌量減少。

(3) 2-8℃冰箱中存放超過2周的平板中的菌落已經(jīng)開始死亡，不再適合接種培養(yǎng)。

(4) 細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間不應(yīng)超過16小時(shí)。培養(yǎng)時(shí)間超過16小時(shí)的細(xì)菌開始出現(xiàn)自溶現(xiàn)象，可能因此導(dǎo)致質(zhì)粒DNA的得率降低。

(5) 用于細(xì)菌培養(yǎng)的培養(yǎng)基所占容器的體積不應(yīng)大于1/4。