在生物制品行業中,不同物種來源的同一生物制品價格差異較大,進而催生了利用生物制品中殘留的DNA鑒定物種來源的技術。但由于現有市場上物種源性的鑒定技術主要以定性檢測為主,導致用戶收到的鑒定結果常常是一個產品中不同的物種都呈陽性,這給廣大用戶(特別是同一生產設備、車間生產有不同物種來源的同一生物制品的生產廠家)帶來了很大的疑惑:物種DNA鑒定的方法一點都不靠譜,不準確或不靈敏。
實際上恰恰相反,由于PCR檢測太靈敏了,只要有幾個可作為DNA模板的分子存在,檢測結果就是陽性。本實驗室近期收到山東一家生產血漿蛋白粉的廠家委托的檢測:他的一批豬血漿蛋白粉被鑒定為含有雞源DNA組份,懷疑是假冒的豬血蛋白粉,希望我們提供更有價值的檢測方法。
我們的建議是:請廠家提供一份純的雞血漿蛋白粉樣本和一份被懷疑是假冒豬血蛋白粉的樣本,一起用熒光定量PCR的方法鑒定其中雞源DNA的含量,如果兩者雞源DNA測出的含量相差懸殊,應視為雞源DNA蛋白粉的污染,而不應視為以雞源蛋白粉假冒豬源蛋白粉。
下面小編以為用戶鑒定雞源DNA濃度為例,比較定性鑒定與定量鑒定的差別:
實驗樣本:雞肉,1號血漿蛋白粉樣本(雞源),2號血漿蛋白粉樣本(被懷疑是假冒豬血漿蛋白粉的雞血漿蛋白粉)
實驗試劑:動物組織DNA試劑盒(simgen,cat.No.:3101050),全血/培養細胞DNA試劑盒(simgen,cat.No.:3002050),PBS溶液(simgen,cat.No.:9004500)。
DNA提取步驟:
提取雞肉組織的基因組DNA按動物組織DNA試劑盒說明書操作,用100μl Buffer TE 洗脫DNA。
血漿蛋白粉按以下步驟操作:
1. 取50mg血漿蛋白粉樣本溶于200μl PBS溶液,加20μl蛋白酶K混勻。
2. 然后按全血/培養細胞DNA試劑盒說明書(從全血、唾液、培養細胞、精液及革蘭氏陽性菌中分離純化總DNA)步驟二接下去操作,用100μl Buffer TE 洗脫DNA。
實驗器材及差異步驟:
圖一PCR電泳圖
M 1 2 3 4
M:DNA Marker
1:陽性對照
2:1號樣本
3:2號樣本
4:陰性對照
圖二 熒光PCR結果熒光曲線圖
圖三 熒光PCR探針法結果CT值表
從圖一可以看出1號樣本及2號樣本均呈現為與陽性條帶一致的帶型,陰性條帶為引物二聚體的帶型;2號樣本的電泳帶比1號的電泳帶稍暗,說明2號樣本中的雞源DNA比1號樣本少,但是并不能確定數量上差異多少。
我們再看圖二,1號樣本的熒光曲線起線比2號靠前,說明1號樣本的雞源DNA比2號多,再從圖三CT值表看,可以知道1號樣本的CT值比2號小6.45個CT值,說明1號樣本的雞源DNA比2號高26.43倍,即大約86倍。也就是說,如果要摻假的話,2號樣本中應當是取85份豬血漿蛋白粉+1份雞血漿蛋白粉混合而成的--這個摻假實在沒有利用價值,所以更好解釋應當是生產環境中的雞血漿蛋白粉殘留物污染了豬血漿蛋白粉。