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上期我們用Carrier RNA代替病毒測(cè)試了病毒樣本保存液和RNA樣本保存液對(duì)唾液中病毒RNA的保存效果，發(fā)現(xiàn)兩者差別不大，對(duì)唾液中的Carrier RNA均有較好的保護(hù)作用。但是Carrier RNA和病毒畢竟還是有差別的，不能按Carrier RNA的測(cè)試結(jié)果直接推導(dǎo)出病毒樣本測(cè)試的結(jié)果。下面就讓我們用新冠假病毒（新冠假病毒：將新型冠狀病毒（2019-nCoV，參考序列為NC_045512）的E基因序列合成并克隆構(gòu)建至慢病毒載體，在293T細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行假病毒的制備。所獲得的假病毒為慢病毒基因組中包含E基因228 base的RNA序列。可以用于病毒RNA提取實(shí)驗(yàn)和qPCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)的對(duì)照品）來測(cè)試一下兩種保存液的效果吧。
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/span>
對(duì)比病毒樣本保存液和RNA樣本保存液對(duì)唾液樣本中病毒RNA的保存效果差異。
二、實(shí)驗(yàn)材料：
1. 病毒樣本保存液（Simgen Cat.No.4112100）
2. RNA樣本保存液（Simgen Cat.No.4007020）
3. 新冠假病毒（108 copies/ml）
4. 新鮮采集的人唾液
5. Carrier RNA（Simgen Cat.No.4003101）
6. 2×One Step Probe RT-PCR Mix（Simgen Cat.No.7406100）
7. 新冠病毒特異性引物及探針（F：CCCTGTGGGTTTTACACTTAA/R：ACGATTGTGCATCAGCTGA，Probe：5’-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3’）
8. 電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，DNP-9082）
9. 旋渦震蕩器（越新儀器，XH-C）
10. 臺(tái)式離心機(jī)（eppendorf Centrifuge 5415 D）
11. 熒光PCR儀（ABI 7500）
三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：
用唾液將假病毒稀釋至106 copies/ml，按比例與不同保存液進(jìn)行混合，然后分成兩份，一份放入37℃恒溫箱中，另一份放入﹣20℃冰箱中，每隔一周提取一次RNA（每種實(shí)驗(yàn)條件重復(fù)一管），并進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，觀察保存液的保存效果。
RNA樣本保存液：唾液=3:1 | 病毒樣本保存液 ：唾液=2：1 |
1. 將混合液上下翻轉(zhuǎn)混合均勻，吸取100 μl混合液到RNase-free的1.5 ml離心管中，加入300 μl裂解液和1 μl Carrier RNA，旋渦振蕩數(shù)秒混合均勻，室溫靜置10分鐘； 2. 加入320 μl無水乙醇，溫和地翻轉(zhuǎn)離心管3~5次混合均勻； 3. 稍離，吸取液體到核酸純化柱中，13000 rpm離心30秒，棄濾液； 4. 在核酸純化柱中加入600 μl Buffer WA，離心棄濾液； 5. 在核酸純化柱中加入700 μl Buffer WBR，離心棄濾液； 6. 14000 rpm離心1分鐘去除殘留液體； 7. 將核酸純化柱置于一個(gè)RNase-free的1.5 ml離心管中，加入50 μl RNase Free Water，室溫靜置1分鐘，離心洗脫得到RNA。 | 1. 將混合液上下翻轉(zhuǎn)混合均勻，吸取300 μl混合液到RNase-free的1.5 ml離心管中，13000 rpm離心2 min； 2. 吸取上清到新的1.5 ml離心管中，加入300 μl 70%乙醇和1 μl Carrier RNA，溫和地翻轉(zhuǎn)離心管3~5次混合均勻； 3. 稍離，吸取液體到核酸純化柱中，13000 rpm離心30秒，棄濾液； 4. 在核酸純化柱中加入600 μl Buffer WA，離心棄濾液； 5. 在核酸純化柱中加入700 μl Buffer WBR，離心棄濾液； 6. 14000 rpm離心1分鐘去除殘留液體； 7. 將核酸純化柱置于一個(gè)RNase-free的1.5 ml離心管中，加入50 μl RNase Free Water，室溫靜置1分鐘，離心洗脫得到RNA。 |
8. 用2×One Step Probe RT-PCR Mix、新冠病毒特異性引物及探針配置好反應(yīng)液，加入5 μl提取的RNA進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。 | |
四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
RT-PCR擴(kuò)增曲線如下：
實(shí)驗(yàn)當(dāng)天
一周后
兩周后
三周后
CT值如下：
一、 實(shí)驗(yàn)當(dāng)天結(jié)果分析：討論與分析：
由于病毒樣本保存液起始唾液樣本的用量相當(dāng)于RNA樣本保存液的4倍，因此提取到的RNA量也相差4倍，這4倍的濃度差相當(dāng)于2個(gè)CT值。而對(duì)比實(shí)驗(yàn)當(dāng)天提取的RNA RT-PCR反應(yīng)后的CT值，可以發(fā)現(xiàn)RNA樣本保存液保存的樣本的CT值的確比病毒樣本保存液的要大2.2左右，與我們預(yù)想的結(jié)果相符。
二、 第一周實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析：
1. RNA樣本保存液保存的唾液樣本在不同溫度下保存一周后，提取的RNA進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)后的CT值與實(shí)驗(yàn)當(dāng)天的CT值比較增大了約2.1~2.9個(gè)CT值，且37℃和﹣20℃保存的樣本結(jié)果差異不明顯。可以推理出樣本中病毒的RNA降解了約75%以上。
2. 病毒保存液保存的唾液樣本在不同溫度下保存一周后，提取的RNA進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)后的CT值與實(shí)驗(yàn)當(dāng)天的CT值比較增大了約0.3個(gè)CT值，同樣的37℃和﹣20℃保存的樣本結(jié)果差異不明顯。即使兩個(gè)完全相同的熒光PCR反應(yīng)體系，在不同孔間反應(yīng)產(chǎn)生的CT值也會(huì)有差異，因此我們推斷病毒保存液保存的病毒RNA降解得很少，或者降解的程度不嚴(yán)重，未影響后續(xù)的熒光PCR檢測(cè)。
三、 第二周實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析：
1. RNA樣本保存液保存的唾液樣本在37℃下保存兩周后，提取的RNA進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)后的CT值與實(shí)驗(yàn)當(dāng)天的CT值比較仍然是增大了約2.6個(gè)CT值，但奇怪的是﹣20℃保存的樣本提取的RNA進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)后的CT值與實(shí)驗(yàn)當(dāng)天的CT值比較卻增大了約3.7個(gè)CT值。也就是說低溫保存的樣本中的RNA竟然比37℃保存的RNA降解得更嚴(yán)重，和我們預(yù)想中的結(jié)果不符。
2. 病毒樣本保存液的結(jié)果與我們預(yù)想的一致，﹣20℃保存的效果要比37℃保存的效果更好，但是提取的RNA進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)后的CT值與實(shí)驗(yàn)當(dāng)天的CT值比較還是增大了約0.6個(gè)CT值，相當(dāng)于樣本中病毒的RNA已經(jīng)降解了約33%左右。
四、 第三周實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析：
1. RNA樣本保存液保存的唾液樣本在37℃下保存三周后，提取的RNA進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)后的CT值與實(shí)驗(yàn)當(dāng)天的CT值比較增大了約3.4個(gè)CT值，相當(dāng)于樣本中病毒的RNA已經(jīng)降解了約90%左右。同第二周一樣，﹣20℃保存的樣本中的RNA比37℃保存的RNA降解得更嚴(yán)重。
2. 病毒樣本保存液保存的唾液樣本在37℃下保存三周后，實(shí)驗(yàn)獲得的CT值與實(shí)驗(yàn)當(dāng)天的CT值比較增大了大約2.5個(gè)CT值，相當(dāng)于80%的病毒RNA已經(jīng)被降解了，﹣20℃保存的效果第三周和第二周的CT值差別不明顯。
經(jīng)過上述三周的實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們得出以下結(jié)論：
1. 確實(shí)不能按Carrier RNA的測(cè)試結(jié)果直接推導(dǎo)出病毒樣本測(cè)試的結(jié)果，病毒RNA似乎比Carrier RNA更容易降解。雖然上次用Carrier RNA測(cè)試時(shí)推測(cè)兩種保存液保存唾液中RNA病毒樣本的效果差不多，但是通過本次實(shí)驗(yàn)測(cè)試，卻明確地顯示出病毒樣本保存液保存唾液中RNA病毒樣本的效果優(yōu)于RNA樣本保存液。
2. 用病毒樣本保存液保存唾液病毒RNA樣本，在一周內(nèi)無論是存放在37℃或者﹣20℃均不影響后續(xù)病毒核酸檢測(cè)。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，﹣20℃存放的RNA樣本顯示出更好的穩(wěn)定性。所以我們用病毒樣本保存液收集了唾液樣本后最好能在一周內(nèi)提取病毒RNA用于檢測(cè)，如果條件允許，盡量將樣本貯存在﹣20℃。
3. 雖然病毒樣本保存液的保存效果更好，但是由于病毒樣本保存液會(huì)將病毒顆粒溶解，病毒RNA肯定會(huì)處于一個(gè)緩慢的降解過程中，否則第二周和第三周測(cè)的CT值也不會(huì)增大了。那為什么第一周內(nèi)在CT值上的差異并不明顯呢？我們猜測(cè)是一周內(nèi)的病毒RNA的降解程度尚未影響到病毒RNA作為PCR擴(kuò)增有效模板的緣故。以本次實(shí)驗(yàn)用的假病毒為例，其RNA長(zhǎng)度約為6200 nt，而我們的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度僅為119 nt。如果降解后的片段主要是集中在2000-3000 nt，則仍然是遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于擴(kuò)增片段長(zhǎng)度的，就不會(huì)對(duì)擴(kuò)增結(jié)果有明顯的影響。感興趣的讀者可以看一下之前發(fā)的文章——《模板DNA完整性對(duì)PCR結(jié)果的影響》，里面有詳細(xì)的講解。
