蘄蛇是蝰科動物五步蛇的干燥體，具有祛風、通絡、止痙的功效。近年來，由于資源有限，價格昂貴，出現了用其他蛇冒充蘄蛇或在蘄蛇體內摻假的現象，因此近些年的《中國藥典》中蘄蛇鑒定方法改為聚合酶鏈式反應法（PCR法）。前段時間江西百仁中藥找到了我們，想讓我們設計一套方案來鑒定蘄蛇的真偽，并寄來了一些蘄蛇測試樣本。現在我們把鑒定真偽蘄蛇的方法分享給大家。

一、實驗目的：

提取蘄蛇樣本中的DNA，用聚合酶鏈式反應法（PCR法）對蘄蛇進行真偽鑒定。

二、實驗材料：

1. 蘄蛇待檢樣品（曬干的蛇肉）和陽性對照品（粉末狀）

2. 動物組織DNA試劑盒（Simgen Cat.No.3101050）

3. 2×Taq plus PCR Master Mix（Simgen Cat.No.7005100）

4. 蘄蛇特異性引物（F:5’-GGCAATTCACTACACAGCCAACATCAACT-3’ /R:5’-CCATAGTCAGGTGGTTAGTGATAC-3’）

5. 超微量電子天平（DENVER INSTRUMENT，TP-213）

6. 電子恒溫不銹鋼水浴鍋（上海宜昌儀器紗篩廠）

7. 旋渦震蕩器（越新儀器，XH-C）

8. 臺式離心機（eppendorf Centrifuge 5415 D）

9. 超微量分光光度計（SIMGEN Cat.No.sim100）

10. 電泳儀（北京六一儀器廠，DYY-6C型 ）

11. PCR儀（Techne FPROGO5Y Progene Thermal）

三、實驗內容：

本次實驗使用Simgen動物組織DNA試劑盒提取蘄蛇樣本DNA，再用Simgen 2×Taq plus PCR Master Mix擴增提取的DNA，具體步驟如下：

1. 用手術刀從待檢樣本上刮下一些組織粉末，稱取25 mg，轉移至1.5 mL離心管中。

2. 加入20 μl蛋白酶K貯存液，再加入180 μl的Buffer AT。

3. 56℃水浴3小時（因為樣本已經曬制成干，較難溶解），期間旋渦震蕩數次幫助組織溶解。

4. 加入200 μl Buffer SL，旋渦震蕩約15秒混勻。將離心管置于70℃水浴10分鐘。

5. 12000 rpm離心1分鐘，吸取上清液轉移到另一個1.5 ml離心管中，加入200 μl無水乙醇，旋渦震蕩約15秒混合均勻。

6. 將溶液加入到核酸純化柱中，12000 rpm離心30秒棄濾液。

7. 加入500 μl Buffer WA，12000 rpm離心30秒棄濾液。

8. 加入600 μl Buffer WB，12000 rpm離心30秒棄濾液。

9. 14000 rpm離心1分鐘去除殘留液體。

10. 將核酸純化柱置于一個潔凈的1.5 ml離心管中，加入100 μl Buffer TE，室溫靜置1分鐘。

11. 12000 rpm離心30秒洗脫得DNA。

12. 在超微量分光光度計上測量提取到的DNA的濃度。

13. 用2×Taq Plus PCR Master Mix擴增蘄蛇特異性引物，配置體系如下表：

4. PCR反應參數設置為；95℃預變性5 min，循環反應35次（95℃ 30s,63℃ 45s），延伸（72℃）5分鐘。

5. 對提取到的DNA和PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳。

四、實驗結果：

1. 在超微量分光光度計上用試劑盒中的Buffer TE調零，測量提取好的DNA，結果如下：

樣品編號1、2為陽性對照樣品提取的DNA；

樣品編號3、4為待檢蛇肉樣品提取的DNA。

2. 在3%的瓊脂糖凝膠上，加入5 μl提取到的DNA和擴增產物，電泳30 min，結果如下：

五、實驗討論與分析 ：

1. 從超微量分光光度計濃度測量結果上分析，不管是陽性對照還是待檢蛇肉樣本提取到的DNA濃度都不高，只有一管待檢蛇肉樣本（3號樣本）提取的DNA濃度稍高一些。推測可能是蘄蛇在風干或制成粉末的過程中降解了DNA，導致最后提取到的DNA量較少。

2. 從電泳圖分析，陽性對照和待檢蛇肉樣本提取的DNA都看不到明顯的條帶，只有一管待檢蛇肉樣本（3號樣本）提取的DNA能隱約看到較暗淡的基因組DNA條帶，與測得的DNA濃度結果有對應關系。

3. 雖然提取到的DNA濃度低，但并不影響PCR擴增，陽性對照和待檢蛇肉樣本提取的DNA均成功擴增出了條帶，且兩者位置一致，證明待檢蛇肉樣本確實是蘄蛇。

4. 本次PCR擴增中，由于DNA濃度低，相應的增加了模板DNA的用量，達到了15 μl。如此高的模板用量，PCR擴增卻沒有受到影響，說明了動物組織DNA試劑盒提取的DNA潔凈度高，抑制物少。