方法一:
1.取兩片幼嫩新鮮葉片,置于預冷的研缽中,倒入適量液氮,迅速研磨成粉末狀,隨后加入3ml預熱的2%CTAB抽提緩沖液和50ul抗氧化劑2-巰基乙醇,繼續研磨成略有流動性的糊狀或粥狀,轉入1.5ml的離心管中,于65℃水浴鍋中保溫約60min。
2.待混合物冷卻至室溫后加入等600ul的CI(氯仿:異戊醇=24:1)溶液混勻,輕輕顛倒離心管幾次使管內混合物成乳濁液,常溫下10000rpm離心10min,取上清液轉入另一干凈的離心管中。
3.重復步驟(2)一次。
4.取步驟(3)上清液加入2.5倍體積無水乙醇,仔細混勻,-20冰箱30min以上,沉淀DNA 4℃,12000rpm離心10min。
5.棄去上層有機溶劑,加500ul75%乙醇洗滌沉淀,4℃下8000rpm離心5min,棄去上清,洗滌沉淀3次。
6.倒置或者37度培養箱烘干。
7.加50ulTE緩沖液溶解DNA,于-20℃冷藏備用。
方法二:
1. 在50ml離心管中加入20ml提取緩沖液Ⅰ, 60℃水浴預熱。
2. 植物5-10g, 剪碎, 在研缽中加液氮磨成粉狀后立即倒入預熱的離心管中, 劇烈搖動混勻, 60℃水浴保溫30-60分鐘(時間長,DNA產量高), 不時搖動。
3. 加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液, 顛倒混勻(需帶手套, 防止損傷皮膚),室溫下靜置5-10分鐘, 使水相和有機相分層(必要時可重新混勻)。
4. 室溫下5000rpm離心5分鐘。
5. 仔細移取上清液至另一50ml離心管,加入1倍體積異丙醇,混勻,室溫下放置片刻即出現絮狀DNA沉淀。
6. 在1.5mleppendorf中加入1ml TE。用鉤狀玻璃棒撈出DNA絮團,在干凈吸水紙上吸干,轉入含TE的離心管中,DNA很快溶解于TE。
7. 如DNA不形成絮狀沉淀,則可用5000rpm離心5分鐘, 再將沉淀移入TE管中。這樣收集的沉淀,往往難溶解于TE,可在60℃水浴放置15分鐘以上,以幫助溶解。
8. 將DNA溶液3000rpm離心5分鐘,上清液倒入干凈的5ml離心管。
9. 加入5μlRNaseA(10μg/μl), 37℃ 10分鐘, 除去RNA(RNA對DNA的操作、分析一般無影響,可省略該步驟)。
10. 加入1/10體積的3mol/L NaAc及2×體積的冰乙醇,混勻,-20℃放置20分鐘左右,DNA形成絮狀沉淀。
11. 用玻棒撈出DNA沉淀,70%乙醇漂洗,再在干凈吸水紙上吸干。
12. 將DNA重溶解于1ml TE, -20貯存。
13. 取2μlDNA樣品在0.7% Agarose膠上電泳, 檢測DNA的分子大小。同時取15μl稀釋20倍, 測定OD260/OD280, 檢測DNA含量及質量。
方法三:
植物DNA的SDS提取法:
試驗試劑:
1、研磨緩沖液:稱取59.63gNaCl,13.25g檸檬酸三鈉,37.2gEDTA-Na分別溶解后合并為一,用0.2mol/L的NaOH調至pH7.0,并定容至1000ml。
2、10×SSC溶液:稱取87.66gNaCl和44.12g檸檬酸三鈉,分別溶解,一起定容至1000ml。
3、1×SSC溶液:用10×SSC溶液稀釋10倍。
4、0.1×SSC溶液:用1×SSC溶液稀釋10倍。
5、Rnase溶液:用0.14mol/LNaCl溶液配制成25mg/ml的酶液,用1mol/LHCl,pH至5.0,使用前經80℃水浴處理5min(以破壞可能存在的Dnase)。
6、氯仿-異戊醇:按24ml氯仿和1ml異戊醇混合。
7、5mol/L高氯酸鈉溶液:稱取NaClO4·H2O 70.23g,先加入少量蒸餾水溶解再容至100ml。
8、SDS(十二烷基硫酸鈉)化學試劑的重結晶:將SDS放入無水酒精中達到飽和為止,然后在70~80℃的水浴中溶解,趁熱過濾,冷卻之后即將濾液放入冰箱,待結晶出現再置室溫下涼干待用。
9、1mol/LHCl。
10、0.2mol/LNaOH。
11、二苯胺乙醛試劑:1.5g二苯胺溶于100ml冰醋酸中,添加1.5ml濃硫酸,裝入棕色瓶,貯存暗處,使用時加0.1ml乙醛液〔濃乙醛:H2O=1:50(V/V)〕。
12、1.0mol/L高酸溶液(HClO4)。
13、0.05mol/LNaOH。
14、DNA標準液:取標準DNA25mg溶于少量0.05mol.L-1NaOH中,再用0.05mol/LNaOH定容至25ml,后用移溶管吸取此液5ml至50ml容量瓶中,加5.0ml1mol/LHClO4,混合冷卻后用0.5mol/LHClO4定容至刻度,則得100μg/ml的標準溶液。
實驗步驟:
1、稱取植物幼嫩組織10g剪碎置研缽中,加10ml預冷研磨緩沖液并加入0.1g左右的SDS,置冰浴上研磨成糊狀。
2、將勻漿無損轉入25ml刻度試管中加入等體積的氯仿-異戊醇混合液,加上塞子,劇烈振蕩30s,轉入離心管,靜置片刻以脫除組織蛋白質。以4000rpm離心5min。
3、離心形成三層,小心地吸取上層清液至刻度試管中,棄去中間層的細胞碎片、變性蛋白質及下層的氯仿。
4、將試管置72℃水浴中保溫3min(不超過4min),以滅活組織的DNA酶,然后迅速取出試管置冰水浴中冷卻到室溫,加5mol/L高氯酸鈉溶液〔提取液:高氯酸鈉溶液=4:1(V/V)〕,使溶液中高氯酸鈉的最終濃度為1mol/L。
5、再次加入等體積氯仿-異戊醇混合液至大試管中,振蕩1min,靜置后在室溫下離心(4000rpm)5min,取上清液置小燒杯中。
6、用滴管吸95%的預冷乙醇,慢慢地加入燒杯中上清液的表面上,直至乙醇的體積為上清液的兩倍,用玻璃棒輕輕攪動。此時核酸迅速以纖維狀沉淀纏繞在玻璃棒上。
7、然后加入0.5ml左右的10×SSC,使最終濃度為1×SSC。
8、重復第6步驟和第7步驟即得到DNA的粗制品。
9、加入已處理的Rnase溶液,使其最后的作用濃度為50~70μg/ml,并在37℃水浴中保溫30min,以除去RNA。
10、加入等體積的氯仿-異戊醇混合液,在三角瓶中振蕩1min,再除去殘留蛋白質及所加Rnase蛋白,室溫下以4000rpm離心5min,收集上層水溶液。
11、再按6、7步驟處理即可得到純化的DNA液。
方法四:
改進的SDS法提取植物葉片基因組DNA
1、取指甲大小的植物葉片,置于研缽中,加入適量液氮,用研棒磨成粉未(越細越好)。
2、將粉末移入1.5 ml離心管,加入DNA提取洗滌液1.5 ml,輕輕顛倒混勻。
3、8000 rpm離心10 min,棄上清,加入洗滌液1 ml,混勻,8000 rpm離心10min,棄上清,共洗滌2遍。
4、加入預熱的DNA裂解液500 μL,用牙簽輕輕攪拌均勻,置65℃水浴30 min。
5、水浴后立即加入苯酚/氯仿/異戊醇500 μL,顛倒數次,這時溶液變為乳白色,10000 rpm離心5min,取上清液至新的1.5ml離心管中。
6、加入55 μL醋酸鉀,顛倒混勻,10000 rpm離心10min,取上層清液轉移至新的1.5ml離心管中。
7、加入異丙醇300 μL,室溫30 min或-20℃放置2 hr,12000 rpm離心10min,棄上清,取沉淀,加入500μL70%乙醇,室溫放置2 min,12000 rpm離心5 min,棄上清,取沉淀。
8、加入30 μL含5 g/ml RNase 的TE緩沖液,37℃水浴放置1hr。
9、離心30 s后,取10 μL于0.8%瓊脂糖凝膠上進行電泳鑒定。
方法五:
植物DNA的CTAB提取法:
1、稱取新鮮葉片2-3g,剪碎放入研缽中,在液氮中研磨成粉末。
2、將粉末轉移到加有7ml經預熱的15×CTAB提取緩沖液15ml離心管中,迅速混勻后置于65℃水浴中,溫育30min。
3、取出離心管,冷卻至室溫,加入氯仿/異戊醇(24:1),充分混勻,室溫下2300轉離心20min。
4、將上清轉移至另一新的15ml離心管中,加入1/10體積10%的CTAB和等體積的氯仿/異戊醇。充分混勻,2300rpm離心20min。
5、轉移上清至另一新的15ml離心管中,加入等體積1%的CTAB沉淀緩沖液,輕輕搖晃至形成DNA絮狀沉淀。1000rpm離心10min,使DNA沉淀于管底。
6、加入1.5-2ml的1mol/LNaCl及5μlRNase置于56℃水浴中過夜。
7、待DNA完全溶解后,加2-3ml4℃預冷的95%的冰乙醇使DNA沉淀,挑出DNA,置于15ml離心管中,用70%乙醇清洗30min。
8、離心機甩5s,倒出70%乙醇,再用95%乙醇浸泡5min,倒出95%乙醇,在超凈工作臺上吹干。
9、將風干的DNA直接在4℃保存備用或溶于100μlTE溶液中于-20℃保存。