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之前有個(gè)客戶投訴說我們的全血DNA小量試劑盒提取的血液DNA濃度很低，效果不好。小新感覺很奇怪，全血DNA小量試劑盒是我們的明星產(chǎn)品，采用專利技術(shù)方法提取的血液DNA，比市場(chǎng)上的血液DNA提取試劑盒操作更加簡(jiǎn)便，加上樣本用量大，提取同一個(gè)血樣的時(shí)候，DNA濃度通常只會(huì)更高----于是小新立刻與客戶進(jìn)行了溝通，經(jīng)過詳細(xì)詢問才發(fā)現(xiàn)原來客戶之前經(jīng)常提取質(zhì)粒DNA，這次提取血液時(shí)怕劇烈操作會(huì)弄斷基因組DNA，因此沒有按照說明書寫的劇烈操作，而是溫和地操作。
為了驗(yàn)證是否是這個(gè)原因?qū)е绿崛〉?/span>DNA濃度低，小新決定實(shí)際測(cè)試一下。由于Simgen細(xì)菌DNA試劑盒同樣采用了全血DNA小量試劑盒的專利技術(shù)提取基因組DNA，小新決定先用細(xì)菌樣本測(cè)試一下。
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/span>
測(cè)試細(xì)菌DNA試劑盒提取過程中劇烈操作與溫和操作對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。
二、實(shí)驗(yàn)材料：
過夜培養(yǎng)的DH5α細(xì)菌、細(xì)菌DNA試劑盒（Simgen Cat. No.3302050）
旋渦震蕩器（越新儀器，XH-C）
臺(tái)式離心機(jī)（eppendorf Centrifuge 5415 D）
超微量分光光度計(jì)（Simgen Cat.No.sim100）
電泳儀（北京六一儀器廠，DYY-6C型 ）
三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：
劇烈操作 | 溫和操作 |
1. 用1.5 ml離心管收集3 ml細(xì)菌培養(yǎng)物，加入200 μl Buffer TE，旋渦震蕩充分懸浮細(xì)菌。 2. 加入100 μl溶菌酶溶液，旋渦震蕩約15秒混勻，37℃水浴30分鐘。 3. 加入225 μl Buffer L1，旋渦震蕩30秒。 | |
4. 加入225 μl Buffer L2，劇烈搖晃離心管3~5次，再旋渦震蕩30秒混勻。 | 4. 加入225 μl Buffer L2，溫和的上下顛倒混勻30秒。 |
5. 13000 rpm離心2分鐘。 6. 將步驟5中的上清液倒入到核酸純化柱中（核酸純化柱置于2 ml離心管中），蓋上管蓋，12000 rpm離心30秒。 7. 棄2 ml離心管中的濾液，將核酸純化柱置回到2 ml離心管中，在核酸純化柱中加入500 μl Buffer WA, 蓋上管蓋，12000 rpm離心30秒。 8. 棄2 ml離心管中的濾液，將核酸純化柱置回到2 ml離心管中，在核酸純化柱中加入600 μl Buffer WB, 蓋上管蓋，12000 rpm離心30秒。 9. 棄2 ml離心管中的濾液，將核酸純化柱置回到2 ml離心管中，14000 rpm離心1分鐘。 10. 棄2 ml離心管，將核酸純化柱置于一個(gè)潔凈的1.5 ml離心管中，在純化柱中央加100 μl 37℃溫育的Buffer TE，蓋上管蓋，室溫靜置1分鐘，12000 rpm離心30秒。 11. 洗脫下來的DNA測(cè)量濃度并進(jìn)行電泳檢測(cè)。 | |
四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
1. 在超微量分光光度計(jì)上用Buffer TE調(diào)零，測(cè)量提取的DNA，結(jié)果如下：
2. 在1%的瓊脂糖凝膠上，加入5 μl提取到的DNA，電泳30 min，結(jié)果如下：
五、實(shí)驗(yàn)討論與分析：
1. 從超微量分光光度計(jì)測(cè)量的結(jié)果上可以看出，劇烈操作提取的DNA濃度是溫和操作提取的4倍以上，Abs260/280幾乎沒有差別，而Abs260/230值劇烈操作提取的DNA更好 。
2. 從電泳圖上可以看到，兩種操作方法提取的DNA電泳的位置差不多，劇烈操作提取的DNA的亮度要明顯亮于溫和操作提取的DNA，與分光光度計(jì)測(cè)得的數(shù)據(jù)有較好的對(duì)應(yīng)關(guān)系。
大腸桿菌的基因組DNA長(zhǎng)度是4.7×106 bp，也就是說有接近5000 kb的長(zhǎng)度，這么長(zhǎng)的DNA是非常容易斷裂的（僅僅是用移液器吸取一下DNA溶液就會(huì)對(duì)DNA有一個(gè)剪切的作用），更不用說比細(xì)菌基因組DNA更長(zhǎng)的人類基因組DNA了。這種斷裂在整個(gè)提取過程中都是無法避免的，這就是為什么我們提取到的基因組DNA片段一般都集中在30-50 kb的緣故。
Simgen細(xì)菌DNA試劑盒沒有使用蛋白酶K消化蛋白，所以更需要?jiǎng)×业牟僮鞑襟E使DNA和蛋白質(zhì)分離開，否則基因組DNA就伴隨著沉淀物丟失了。我們從電泳圖中也可以發(fā)現(xiàn)，溫和操作獲得的基因組DNA長(zhǎng)度沒有比劇烈操作獲得的基因組DNA更長(zhǎng)；劇烈操作獲得的基因組DNA也沒有非常嚴(yán)重的拖尾現(xiàn)象。因此建議大家在提取DNA的過程中一定要按照試劑盒說明書上的要求操作，如果遇到懷疑或不理解的操作步驟可以先和技術(shù)支持溝通一下，千萬不要想當(dāng)然地去更改操作方法，否則結(jié)果可能是適得其反。
Simgen實(shí)驗(yàn)室
2020.12.18