冬季一到，陸續又接到幾個用戶反映Simgen快速質粒DNA小量試劑盒提取的質粒DNA存在RNA污染。小新查看用戶的投訴記錄，發現了幾個特點：1.以往的年份也有客戶投訴過相同的問題。2. 投訴率不高，似乎只有某些實驗室有投訴。3.投訴總是發生在冬季，夏季則從來沒有投訴過。以上種種跡象表明試劑盒本身可能不存在問題，誘導的因素是溫度，所以小新猜測應該是溫度降低導致RNase A活性降低這一可能性最大。為了驗證猜測，小新設計了模擬冬夏季溫度條件下進行質粒DNA提取的實驗。

一、實驗目的：

試劑盒使用的環境溫度對RNaseA活性的影響。

二、實驗材料：

含質粒的細菌過夜培養物

快速質粒DNA小量試劑盒（Simgen，Cat.No. 1005050）

電子恒溫水浴鍋（上海宜昌儀器紗篩廠）

冰箱（Haier，BCD-130H）

臺式離心機（eppendorf Centrifuge 5415 D）

旋渦震蕩器（越新儀器，XH-C）

超微量分光光度計（Simgen Cat.No.sim100）

電泳儀（北京六一儀器廠，DYY-6C型） 

三、實驗方法：

取一盒快速質粒DNA小量試劑盒，加好RNase A和無水乙醇，將除了BufferⅡ外的所有試劑都分成兩份，其中一份放到37℃的水浴鍋中，模擬夏天的溫度；另一份放到4℃冰箱，模擬冬天室溫。BufferⅡ放在37℃的水浴鍋中（因為BufferⅡ低溫易結晶，冬季也會先放在37℃水浴）。

為了更容易觀察到RNA污染的效果，小新特別用了最大量（5 ml）的細菌培養物，分別用這兩份不同溫度存放的試劑提取質粒DNA，實驗步驟如下：

1. 12000 rpm離心30秒收集 5 ml 過夜培養的細菌，棄盡培養基。加入 250 μl已加入 RNase A 的 Buffer I。

2. 加入250 μl Buffer II ，溫和并充分地翻轉離心管 4-6次。

3. 加入 350 μl Buffer N8，溫和并充分地翻轉離心管直至溶液中殘留的藍色沉淀全部消失，轉變為淡黃色沉淀。

4. 最高速（≧12000 rpm）離心 2 分鐘。

5. 將核酸純化柱置于 2 ml 離心管中，將步驟 4 中的上清液倒入核酸純化柱中，蓋上管蓋，12000 rpm離心 30秒。

6. 棄 2 ml離心管中的濾液，將核酸純化柱置回到 2 ml離心管中，在核酸純化柱中加入800 μl Buffer W2,  蓋上管蓋，12000 rpm離心30秒 。

7. 棄 2 ml離心管中的濾液，將核酸純化柱置回到 2 ml離心管中，最高速（≧12000 rpm）離心1分鐘。

8. 棄 2 ml離心管，將核酸純化柱置于一個潔凈的 1.5 ml離心管中，在純化柱的膜中央加入60 μl Buffer E ，蓋上管蓋，室溫靜置1分鐘，12000 rpm離心30秒。

9. 棄純化柱，得到質粒DNA。

四、實驗結果：

1. 在超微量分光光度計上用試劑盒的Buffer E調零，測量洗脫下來的DNA，結果如下：（表一）

樣品名稱	Abs260	Abs280	Abs230	260/230	260/280	濃度ng/μl
4℃	11.679	5.788	5.581	2.09	2.02	583.9508
4℃	11.560	5.710	5.516	2.10	2.02	577.9800
4℃	9.761	4.839	4.518	2.16	2.02	488.0405
4℃	9.987	4.887	4.735	2.11	2.04	499.3611
37℃	5.280	2.668	2.529	2.09	1.98	263.9873
37℃	5.181	2.617	2.484	2.09	1.98	259.0307
37℃	5.254	2.644	2.522	2.08	1.99	262.6758
37℃	4.875	2.439	2.312	2.11	2.00	243.7359

2. 在1%的瓊脂糖凝膠上，加入8 μl（加大上樣電泳體積的目的是便于觀察殘留的RNA）洗脫的DNA，電泳5分鐘（注意如果電泳時間太長，殘留的RNA也會因彌撒而觀察不到的），結果如下：

1. 從表一和圖一可知，放置在4℃的試劑提取出來的質粒DNA中RNA含量明顯比放置在37℃的試劑提取出來的質粒DNA中RNA含量多，驗證了低溫環境下快速質粒DNA小量試劑盒提取的質粒DNA中RNA污染會比較嚴重這一現象。

2. 從圖二中可以看到，上午和下午提取的質粒DNA中的RNA殘留情況雖然肉眼對比差異不明顯，但是對比表一和表二的數據就可以發現，下午提取的質粒DNA的Abs_260/280比上午提取的要小一些，濃度也低一些，說明下午提取的質粒DNA中RNA殘留情況要低于上午提取的質粒DNA。

3. 盡管小新用37℃溫育后的Buffer I、Buffer II、Buffer N8來模擬夏天的條件，但需要注意的一點是，環境溫度仍然是不滿足夏天條件的（比如離心管的溫度、吸頭的溫度，離心機的溫度等等），這應該是37℃溫育試劑提取質粒DNA仍然殘留有少量RNA的主要原因。

大家都知道RNA酶很皮實，耐高溫，但是再怎么樣終歸還是酶，最適溫度就是37℃（Simgen 質粒試劑盒中的RNA酶來自牛胰，牛的正常體溫是38℃～39.5℃，所以最適溫度可能還要再高一點）左右，一到冬季自然大打折扣。既然小新的實驗驗證了冬季RNase A活性降低是質粒提取試劑盒被投訴的主要原因，那小新就可以開始對癥下藥了：

1. 冬天提取質粒DNA的時候，直接把快速質粒DNA小量試劑盒放到恒溫箱里溫育（反正Buffer II冬天會結晶，就是需要提前溫育的）到37℃后再使用。

2. 把實驗室的空調開高一些，等溫度升高后再做實驗（記得有一年實驗室一直不能重復出用戶投訴的RNA污染結果，現在懷疑和空調溫度打得太高了也有一定的關系）。

3. 不要急著做實驗，把養好的細菌涼一涼再做（等個4~5個小時，因為細菌在不良的生長環境下會減少新陳代謝，RNA會自行降解掉一部分）。

4. 減少細菌的用量，RNA酶需要消化的RNA總量就減少了。

5. 最后一招，如果不缺錢，干脆再采購一支RNase A加到Buffer I中，那效果也是立竿見影的。

以上的解決方案中1~4條都是偷懶的行為，說明在了解事物本質的前提下，適當地偷懶反而能達到事半功倍的效果。