一、實驗目的：

檢測3包干粉和4管斜面培養菌中是否含有目的菌種。

二、實驗材料及設備：

1.樣品：送檢的3包干粉樣本，4管斜面培養菌，已標注1~7號，由客戶提供。

2.全血/培養細胞DNA試劑盒（simgen，Cat.No.3002050）。

3.2×PCR Mix（simgen，Cat.No.7003100），DL 2000 DNA Marker，目的菌種特異性引物（BC-F：5-TACGGCATTGGCAAGTATCA-3；BC-R：5-CGACATGATTTGGTTTTCCA-3）（BS-F：5-CAGGCTCACACTTTGTCTTG-3；BS-R：5-TGAACACAGTCCTGGGTTAG-3）為客戶提供。

4. PCR儀：Techne FPROGO5Y Progene Thermal.

5.離心機：Thermo Biofuge pico.

6.無菌超凈工作臺、氣浴恒溫振蕩器、微量紫外分光光度計、電泳儀。

三、實驗方法：

（一）菌液收集

1. 在無菌超凈臺中取3個滅菌處理過的50ml離心管，倒入15ml滅菌處理過的ddH₂O。

2. 將干粉倒入離心管中，蓋好管蓋，標記序號4、5、6。

3. 將離心管漩渦振蕩混勻，靜置半小時。

4. 用1.5 ml離心管收集3ml靜置上清液，標記序號4、5、6。

5. 向斜面培養基中加入6ml滅菌處理過的ddH₂O，用移液槍吹打使菌懸浮。

6. 用1.5 ml離心管收集3ml懸浮液，標記1、2、3、7。

（二）菌液DNA提取：

1. 向1~7號1.5 ml離心管加入100 μl Buffer TE，旋渦振蕩充分懸浮。加入100 μl溶菌酶溶液，旋渦振蕩約15秒混勻，37 ℃水浴30分鐘。

2. 加入20 μl蛋白酶K貯存液，加入200 μl Buffer SL，旋渦振蕩約15秒混勻。將離心管置于56 ℃水浴10分鐘。

3. 12000 rpm離心1分鐘，取400 μl上清液轉移到新的1.5 ml離心管中。

*本步驟是額外增加的，為了除去菌液中混有的不溶物質。

*若上清液不足400 μl也無妨，小心不要吸入沉淀。

4. 加入200 μl無水乙醇，旋渦振蕩約15秒混勻。

5. 吸取步驟4中的溶液加入到核酸純化柱（純化柱置于2 ml離心管中）中，蓋上管蓋，12000 rpm離心30秒。

6. 棄2 ml離心管中的濾液，將核酸純化柱置回到2 ml離心管中，在核酸純化柱中加入500μl Buffer WA, 蓋上管蓋，12000 rpm離心30秒。

7. 棄2 ml離心管中的濾液，將核酸純化柱置回到2 ml離心管中，在核酸純化柱中加入600 μl Buffer WB, 蓋上管蓋，12000 rpm離心30秒。

8. 棄2 ml離心管中的濾液，將核酸純化柱置回到2 ml離心管中，蓋上管蓋，14000 rpm離心1分鐘。

9. 棄2 ml離心管，將核酸純化柱置于一個潔凈的1.5 ml離心管中，在純化柱的膜中央加入80 μl 56℃溫育的Buffer TE，蓋上管蓋，室溫靜置1分鐘，12000 rpm離心30秒。

10. 棄純化柱，洗脫的DNA在微量紫外分光光度計上測量濃度。

（三）PCR擴增

1.用ddH₂O將引物稀釋到10μM。

2.按下表配制PCR擴增體系：

按9管的量配制混合液，并以每管35 μl分至8個離心管（PCR反應管）中。

* 其中有一管是陰性對照組。

3.向其中一管PCR反應體系的混合液中加入5 μl ddH₂O 作為陰性對照組，剩余的加入5μl 提取的DNA，標好序號，充分混勻，簡短離心以收集殘留在管壁的液體。

4.進行PCR擴增，反應參數如下：

三、實驗結果：

1.在微量紫外分光光度計上用Buffer TE調零，測量洗脫下來的DNA，結果如下：

2.配制2%的瓊脂糖凝膠，依次加入5 μl DL 2000 DNA Marker、5 μl待檢樣本DNA擴增產物和陰性對照，接通電源，電泳30分鐘，結果如下：

       圖一（BC引物）                  圖二（BS引物）

M：DL 2000 DNA Marker  

1~7:1~7號待檢測菌   

8：陰性對照

四、實驗結論：

1. BC引物擴增的特異性條帶為555bp，圖一中，1,2,3號出現明顯的目的條帶，而7號雖然也有條帶出現，但長度在1000bp以上，并不是目的條帶，而其他樣本并未擴增出條帶，所以1,2,3號樣本中含有凝結芽孢桿菌，4,5,6,7號樣本中不含凝結芽孢桿菌。

2. BS引物擴增的特異性條帶為1287bp，圖二中只有6,7號樣本擴增出目的條帶，其余樣本均為出現條帶，所以6,7號樣本中含有枯草芽孢桿菌，1,2,3,4,5號樣本中不含枯草芽孢桿菌。